Prosjektnummer
901690
Metode som bruker kitinolytiske enzymer til å forebygge og kontrollere lakselus
Ny kunnskap om en ny behandlingsmetode som bruker kitinolytiske enzymer for å forebygge og kontrollere lakselus
• SmChiC og VaLPMO ble valgt ut som de best egnede enzymkandidatene for marine forhold
(pH 8, 0,6M NaCl og 12 ℃). Enzymproduksjon ble oppskalert til 30 liters fermentor med
påfølgende frysetørking.
• Når lakselus inkuberes med kitinolytiske enzymer frigis kitooligosakkarider.
• In vitro-forsøk hvor levende lakselus eksponeres for kitinolytiske enzymer viser en tendens til at lakselus dør raskere. Det er imidlertid viktig å merke seg at metoden ikke er godt egnet for å se på langtidsvirkninger av enzymene.
• In vitro-forsøk på levende rekelarver viser at 10 mg/liter kitinolytiske enzymer ikke påvirker overlevelse, utvikling, spiserate eller svømming hos rekelarvene.
• In vivo-forsøk hvor lakselus på fisk ble eksponert for kitinolytiske enzymer viste ingen forskjell mellom kontroll- og behandlingsgruppen.
• Når lakselus inkuberes med kitinolytiske enzymer frigis kitooligosakkarider.
• In vitro-forsøk hvor levende lakselus eksponeres for kitinolytiske enzymer viser en tendens til at lakselus dør raskere. Det er imidlertid viktig å merke seg at metoden ikke er godt egnet for å se på langtidsvirkninger av enzymene.
• In vitro-forsøk på levende rekelarver viser at 10 mg/liter kitinolytiske enzymer ikke påvirker overlevelse, utvikling, spiserate eller svømming hos rekelarvene.
• In vivo-forsøk hvor lakselus på fisk ble eksponert for kitinolytiske enzymer viste ingen forskjell mellom kontroll- og behandlingsgruppen.
Sammendrag av resultater fra prosjektets faglige sluttrapport (Summary in English further below)
I dette prosjektet er det evaluert en ny metode som bruker kitinolytiske enzymer for å kontrollere lakselus, med formålet å undersøke om den kan være et verdifullt tillegg til eksisterende behandlinger. For å kunne vurdere metoden, måtte forskerne først identifisere de mest passende kitinolytiske enzymene og deretter produsere dem. Etter omfattende karakterisering og vurdering ble SmChiC og VaLPMO valgt som de mest optimale enzymene for bruk under marine betingelser (pH 8, 0,6M NaCl og 12 ℃). Oppskalering av enzymproduksjon ble vellykket i en fermentor med kapasitet på 30 liter, og enzymene viste seg å være egnet for både frysing og frysetørking.
Det var også av stor betydning at enzymene produserte kitooligosakkarider når lakselus ble brukt som substrat. I in vitro-forsøk, der levende lakselus ble eksponert for kitinolytiske enzymer, kunne det observeres en tendens til at lakselus døde raskere i nærvær av enzymene. Det er imidlertid viktig å merke seg at slike forsøk ikke egner seg godt for å vurdere langsiktige effekter på lakselus, da lakselus naturlig vil dø når den fjernes fra sin vertsorganisme. Det ble derfor vurdert at det var viktig å utføre undersøkelser av effekten på lakselus som var eksponert for kitinolytiske enzymer in vivo på fisk. Dessverre observerte man ingen signifikant forskjell mellom behandlingsgruppen og kontrollgruppen. Den manglende effekten kan muligens tilskrives det beskyttende slimlaget som omgir lusene på fisken. Det ble forsøkt å undersøke dette ved hjelp av scanning med elektronmikroskopi, men funnene gav ingen entydige svar. Parallelt med fiskeforsøket ble også effekter på “off-target species” undersøkt. Rekelarver eksponert for 10 mg/liter kitinolytiske enzymer viste ingen negative effekter verken på overlevelse, utvikling, spiserate eller svømming.
Konklusjon
Badbehandling med kitinolytiske enzymer har vist seg å ikke være en egnet metode for å behandle luseinfisert fisk. Selv om kitooligosakkarider (nedbrytningsprodukter av kitin) frigis fra lakselus, og in vitro-forsøk på lakselus gir lovende resultater, har det vist seg vanskelig å oppnå effektiv behandling av lakselus på fisken selv. Det som fortsatt gjenstår å utforske, er om bakterier som produserer kitinolytiske enzymer kan benyttes som probiotika i denne sammenhengen.
Results achieved
Summary of results from the project’s final reporting
In this project a new method that utilizes chitinolytic enzymes to control salmon lice has been evaluated, with the aim of investigating whether it could be a valuable addition to existing treatments. To assess the method, one first had to identify the mist suitable chitinolytic enzymes and then produce them. After extensive characterization and evaluation, SmChiC and VaLPMO were selected as the most optimal enzymes for use under marine conditions (pH8, 0.6M NaCl and 12℃). The upscaling of enzyme production was successful in a 30L fermentor, and the enzymes proved suitable for both freezing and freeze-drying.
It was also of significant importance that the enzymes produced chitooligosaccharides when salmon lice were used as a substrate. In in vitro experiments where live salmon were exposed to chitinolytic enzymes, it was observed a tendency for the salmon to die more quickly in the presence of enzymes. However, it is important to notice that such experiments are not well suited for assessing long-term effects om salmon lice, as they naturally die when removed from their host organism. Therefore, it was considered important to conduct studies on the effect of salmon lice exposed to chitinolytic enzymes in vivo on fish. Unfortunately, no significant difference between the treatment group and the control group were observed. The lack of effect may possibly be attributed to the protective mucus layer surrounding the lice on fish. It was tried to investigate this by scanning electron microscopy, but the findings did not provide clear answers. In parallel with the fish experiment, it was also examined the effects on non-target species. Shrimp larvae exposed to 10 mg/L chitinolytic enzymes showed no negative effects on survival, development, feeding rate, or swimming activity.
Conclusion
Bath treatment with chitinolytic enzymes has proven to be an unsuitable method for treating fish infested with salmon lice. Despite the release of chitooligosaccharides (breakdown products of chitin) from salmon lice, as well as promising in vitro results on the lice, it has been challenging to achieve effective treatments of salmon lice on the fish themselves. What remains to be explored is whether bacteria that produce chitinolytic enzymes can be used as a probiotic in this context.
I dette prosjektet er det evaluert en ny metode som bruker kitinolytiske enzymer for å kontrollere lakselus, med formålet å undersøke om den kan være et verdifullt tillegg til eksisterende behandlinger. For å kunne vurdere metoden, måtte forskerne først identifisere de mest passende kitinolytiske enzymene og deretter produsere dem. Etter omfattende karakterisering og vurdering ble SmChiC og VaLPMO valgt som de mest optimale enzymene for bruk under marine betingelser (pH 8, 0,6M NaCl og 12 ℃). Oppskalering av enzymproduksjon ble vellykket i en fermentor med kapasitet på 30 liter, og enzymene viste seg å være egnet for både frysing og frysetørking.
Det var også av stor betydning at enzymene produserte kitooligosakkarider når lakselus ble brukt som substrat. I in vitro-forsøk, der levende lakselus ble eksponert for kitinolytiske enzymer, kunne det observeres en tendens til at lakselus døde raskere i nærvær av enzymene. Det er imidlertid viktig å merke seg at slike forsøk ikke egner seg godt for å vurdere langsiktige effekter på lakselus, da lakselus naturlig vil dø når den fjernes fra sin vertsorganisme. Det ble derfor vurdert at det var viktig å utføre undersøkelser av effekten på lakselus som var eksponert for kitinolytiske enzymer in vivo på fisk. Dessverre observerte man ingen signifikant forskjell mellom behandlingsgruppen og kontrollgruppen. Den manglende effekten kan muligens tilskrives det beskyttende slimlaget som omgir lusene på fisken. Det ble forsøkt å undersøke dette ved hjelp av scanning med elektronmikroskopi, men funnene gav ingen entydige svar. Parallelt med fiskeforsøket ble også effekter på “off-target species” undersøkt. Rekelarver eksponert for 10 mg/liter kitinolytiske enzymer viste ingen negative effekter verken på overlevelse, utvikling, spiserate eller svømming.
Konklusjon
Badbehandling med kitinolytiske enzymer har vist seg å ikke være en egnet metode for å behandle luseinfisert fisk. Selv om kitooligosakkarider (nedbrytningsprodukter av kitin) frigis fra lakselus, og in vitro-forsøk på lakselus gir lovende resultater, har det vist seg vanskelig å oppnå effektiv behandling av lakselus på fisken selv. Det som fortsatt gjenstår å utforske, er om bakterier som produserer kitinolytiske enzymer kan benyttes som probiotika i denne sammenhengen.
Results achieved
Summary of results from the project’s final reporting
In this project a new method that utilizes chitinolytic enzymes to control salmon lice has been evaluated, with the aim of investigating whether it could be a valuable addition to existing treatments. To assess the method, one first had to identify the mist suitable chitinolytic enzymes and then produce them. After extensive characterization and evaluation, SmChiC and VaLPMO were selected as the most optimal enzymes for use under marine conditions (pH8, 0.6M NaCl and 12℃). The upscaling of enzyme production was successful in a 30L fermentor, and the enzymes proved suitable for both freezing and freeze-drying.
It was also of significant importance that the enzymes produced chitooligosaccharides when salmon lice were used as a substrate. In in vitro experiments where live salmon were exposed to chitinolytic enzymes, it was observed a tendency for the salmon to die more quickly in the presence of enzymes. However, it is important to notice that such experiments are not well suited for assessing long-term effects om salmon lice, as they naturally die when removed from their host organism. Therefore, it was considered important to conduct studies on the effect of salmon lice exposed to chitinolytic enzymes in vivo on fish. Unfortunately, no significant difference between the treatment group and the control group were observed. The lack of effect may possibly be attributed to the protective mucus layer surrounding the lice on fish. It was tried to investigate this by scanning electron microscopy, but the findings did not provide clear answers. In parallel with the fish experiment, it was also examined the effects on non-target species. Shrimp larvae exposed to 10 mg/L chitinolytic enzymes showed no negative effects on survival, development, feeding rate, or swimming activity.
Conclusion
Bath treatment with chitinolytic enzymes has proven to be an unsuitable method for treating fish infested with salmon lice. Despite the release of chitooligosaccharides (breakdown products of chitin) from salmon lice, as well as promising in vitro results on the lice, it has been challenging to achieve effective treatments of salmon lice on the fish themselves. What remains to be explored is whether bacteria that produce chitinolytic enzymes can be used as a probiotic in this context.
Prosjektet vil ikke gi noen umiddelbar næringsnytte, siden det ikke ble funnet vesentlig effekt av disse enzymene på lus som sitter på laksen. Likevel er det interessant at enzymene gir effekt på lus ved direkte eksponering, og at det ikke ser ut til å gi skadelige effekter på reker. Mulig fremtidig næringsnytte kan realiseres hvis nye forsøk med enzymene brukt på en annen måte kan vise seg effektivt. For å øke sjansen for dette har FHF påpekt viktigheten av åpen, vitenskapelig publisering.
-
Poster: Exploration of Vibrio natriegens as a host strain for highyield heterologous production of chitinolytic enzymes
NMBU – Norwegian University of Life Sciences. Poster. January 2023. By Martin Larsen (NMBU), Gunnar Thuestad (HVL – Western Norway University of Applied Sciences), Vincent G.H. Eijsink (NMBU), Ingunn Alne Hoel (HVL), and Gustav Vaaje-Kolstad (NMBU).
-
Scientific article: Characterization of genes and proteins related to chitin metabolism in Atlantic salmon
NMBU – Norwegian University of Life Sciences. PhD-thesis 2022:46. By Mathilde Mengkrog Holen.
-
Sluttrapport: Metode som bruker kitinolytiske enzymer til å forebygge og kontrollere lakselus
Sluttrapport fra Høgskulen på Vestlandet (HVL). 28. oktober 2023. Av Ingunn Alne Hoell (HVL), Gunnar Thuestad (HVL), Marianne Nilsen (HVL), Vincent Eijsink (NMBU), Gustav Vaaje-Kolstad (NMBU), Martin Larsen (NMBU) og Renèe Katrin Bechman (NORCE).
Lakseoppdrettsnæringen har behov for gode og miljøvennlige metoder for forebygging og kontroll av lakselus. I det FHF-finansierte prosjektet “Ny metode for å redusere lakselus ved hjelp av kitinolytiske enzymer: Verifiseringsforsøk” (FHF-901651), ble en metode som potensielt kan inaktivere lakselus studert. Enzymene som benyttes har effekt mot alle stadier av lakselus som har skall, men må optimaliseres i forhold til miljøforholdene de skal benyttes ved. Dette prosjektet er en videreføring, med et forsterket fokus på miljøpåvirkning og nytteverdi for oppdrettsnæringen.
Prosjektet inngår i flere faglige satsingsområder ved Høgskulen på Vestlandet (HVL), blant annet “Ansvarlig innovasjon”, “Bærekraftig utvikling” og “Teknologi”. Ved Fakultet for ingeniør og naturvitskap er det i strategi for 2019–2023 pekt på 7 faglige profilområder hvorav dette prosjekt faller inn under følgende satsingsområder: “Havbruk”, “Energi, natur og miljø” og “innovasjon og entreprenørskap”. HVL har som overordnet mål bl.a. å bidra til ny kunnskap som kan løse utfordringer i samfunn og næring i et bærekraftig perspektiv. Dette prosjektet representerer et eksempel på en aktivitet som støtter opp under denne overordnede målsettingen.
Hovedmål
Å framskaffe kunnskap om en ny behandlingsmetode som bruker kitinolytiske enzymer for å forebygge og kontrollere lakselus.
Å framskaffe kunnskap om en ny behandlingsmetode som bruker kitinolytiske enzymer for å forebygge og kontrollere lakselus.
Delmål
1) Å finne de beste enzymene og kombinasjoner av enzymer, samt å finne reaksjonsbetingelser som er optimale, kan anvendes i merdene og maksimere effektiviteten av lytisk polysakkarid monooksygenase (LPMO) (LPMO er en gruppe enzymer som aktivt bryter ned kitin).
2) Å dokumentere effektiviteten av kitinolytiske enzymer mot lakselus slik at vi kan gi anbefalinger som gjelder behandling.
3) Å dokumentere hvordan kitinolytiske enzymer påvirker miljø, villfisk og skalldyr.
Å bruke slike enzymer er en helt ny behandlingsmåte som synes å ha flere fordeler framfor eksisterende metoder:
1. Metoden er tilpasset dagens teknologi med åpne merder.
2. Den er skånsom mot fisken og dermed økes dyrevelferden. Ved forsøk er det vist at det ikke forekommer skade på laks som er blitt behandlet med kitinolytiske enzymer (jf. prosjektet “Ny metode for å redusere lakselus ved hjelp av kitinolytiske enzymer: Verifiseringsforsøk” (FHF-901651)).
3. Enzymene vil virke mot alle stadier av lakselus som har skall, altså også de voksne stadiene hos lakselus.
4. Ved å tilpasse enzymene, kan en behandle mot lakselus uavhengig av årstid (temperatur).
5. Metoden har miljømessige fordeler. Enzymene er proteiner som forventes å brytes ned raskt i naturen. Kitinolytiske enzymer forekommer dessuten naturlig i det marine miljøet. Etter behandling av merden, vil det være enkelt å samle opp et evt. overskudd av enzymer før behandlingsvannet slippes ut i naturen dersom dette skulle vise seg å være nødvendig. Dette kan gjøres ved å tilsette kitin, f.eks i form av rekeskall, som enzymene vil binde seg til.
6. Ettersom enzymene angriper et endeprodukt i syntesen, anses det som mindre sannsynlig at lakselus utvikler resistens fordi det ikke finnes tilbakekoplingsmekanismer.
7. Enzymer kan produseres i stor skala og formuleres som pulver eller konsentrerte løsninger med lang holdbarhet, på linje med vanlig industrielle enzymer. Derfor vil distribusjon til næringen være enkelt.
En foreløpig utfordring har vært å fremskaffe kitinolytiske enzymer i store nok mengder, samt å finne de beste enzymkombinasjoner. Dette prosjektet tar sikte på å gi kunnskapsgrunnlaget, og dermed synliggjøre et markedspotensial, som vil få enzymprodusenter til å etablere industriell enzymproduksjon, og derved gjøre metoden tilgjengelig for oppdrettsnæringen.
Prosjektet vil gjennomføres mellom 01. oktober 2021 og 30. september 2023.
Metode som skal anvendes
Prosjektet vil være delt i 3 faglige arbeidspakker (AP-er), som er knyttet til de tre delmålene definert for dette prosjektet:
AP1: Identifisering, produksjon og karakterisering av kitinolytiske enzymer
Ansvarlig: Norges miljø- og biovitenskapelige universitet (NMBU)
Metode som skal anvendes
a. Identifisere kitinolytiske enzymer som virker effektivt under miljøforholdene i havet (35 ‰ salinitet, lav temperatur og pH 8).
b. Karakterisering av aktuelle enzymer.
c. Produksjon og rensing av utvalgte kitinolytiske enzymer i medium skala.
AP2: Testing av kitinolytiske enzym på levende lakselus under laboratorieforhold og in vivo på fisk
Ansvarlig: HVL
Metode som skal anvendes
a. Eksponeringsforsøk på lakselus for å finne lovende enzymer og enzymkombinasjoner, samt optimale reaksjonsbetingelser, og å bestemme beste behandlingstidspunkt i lakselusens livssyklus.
b. In vivo eksponeringsforsøk. For å gjennomføre forsøk på levende fisk infisert med lakselus, vil man kjøpe tjenester fra et uavhengig laboratorium. Dette sikrer en uavhengig tredjepartsvurdering.
AP3: Vurdering av effekter på miljø, villfisk og krepsdyr
Ansvarlig: HVL
Metode som skal anvendes
a. Vurdering av effekt på miljø vil gjennomføres ved å:
• studere og vurdere nedbrytningshastighet av kitinolytiske enzymer i et marint miljø.
• teste oppsamling av et eventuelt overskudd av enzymer før behandlingsvannet slippes ut.
b. Vurdering av effekt på villfisk ved å gjennomføre et litteraturstudium.
c. Vurdering av biologiske effekter på krepsdyr, med sjøkreps som modellart, vil gjennomføres ved:
b. Vurdering av effekt på villfisk ved å gjennomføre et litteraturstudium.
c. Vurdering av biologiske effekter på krepsdyr, med sjøkreps som modellart, vil gjennomføres ved:
• akutt toksisitetstest (LD50) på sjøkrepslarver.
• eksponeringsforsøk på sjøkrepslarver.
Etter at eventuell immaterielle rettigheter IP er sikret, vil resultatene bli publisert i anerkjent vitenskapelig tidsskrift med fagfellevurdering. Fortrinnsvis åpen publisering (open access) for å nå et bredt publikum.
Resultatene fra prosjektet vil presenteres for oppdrettsnæringen, og vil blant annet bruke HVLs deltakelse i NCE Seafood Innovation Cluster og KABIS (Kapasitetsløft for bærekraftig og innovativ sjømatproduksjon). NMBU vil presentere resultatene på relevante enzym-orienterte konferanser og flagge prosjektet som del av sin bærekrafts satsning. NMBU er en sentral partner i et nytt senter for forskningsdrevet innovasjon (SFI) innen “industriell bioteknologi” (2020–2028, ledet av SINTEF Industri), med flere enn 10 industripartnere, bl.a. fra marin sektor. NMBU vil bruke denne plattformen til å nå ut til næringen, både mulige brukere av teknologien og industrielle enzymprodusenter.
Formidling via aktuelle kommunikasjonsaktiviteter i regi av FHF, slik som FHFs lusekonferanse.
Formidling til allmennheten gjennom f.eks. nyhetsmedier og sosiale medier (eksempelvis slik som Facebook® og LinkedIn®).
Det vil opprettes og oppdateres en prosjektside i systemet Current Research Information SysTems In Norway (Cristin), og prosjektet vil markedsføres via forskningsgruppen Anvendt Marin Mikrobiologi ved HVL.
-
Sluttrapport: Metode som bruker kitinolytiske enzymer til å forebygge og kontrollere lakselus
Sluttrapport fra Høgskulen på Vestlandet (HVL). 28. oktober 2023. Av Ingunn Alne Hoell (HVL), Gunnar Thuestad (HVL), Marianne Nilsen (HVL), Vincent Eijsink (NMBU), Gustav Vaaje-Kolstad (NMBU), Martin Larsen (NMBU) og Renèe Katrin Bechman (NORCE).