Prosjektnummer
900791
Steril laks: Kartlegging av sentrale faktorer i dannelsen av kjønnsceller hos Atlantisk laks
Prosjektet er et skritt fremover for å etablere effektive og gode metoder for produksjon av steril laks uten uheldige effekter på produksjon og fiskevelferd. Proteinet Buc, som har en rolle i etablering av kjønnsceller hos laks, er grundig undersøkt i prosjektet, og anses som en klar kandidat for å utvikle molekylærbiologiske og immunologiske metoder for produksjon av steril fisk.
Sammendrag av resultater fra prosjektets faglige sluttrapport
Kjønnsmodning i oppdrett blir ansett som et problem med hensyn til rømming og interaksjoner med vill fisk, tapt tilvekst og redusert fiskevelferd. Inngående kunnskap om spesifikke gener og proteiner involvert i dannelse og utvikling av kjønn/germceller hos fisk har nå åpnet for å utvikle molekylærbiologiske og immunologiske metoder for produksjon av steril fisk. Prosjektet har undersøkt hvordan ulike gener av avgjørende betydning for etableringen av kjønnscellelinjen uttrykkes gjennom ulike faser av ovarieutviklingen hos laks.
Spesielt har man sett nærmere på Buc-proteinet som tidligere ikke har blitt karakterisert hos laks som har et tetraploid genom. Det ble funnet fire varianter av Buc-genet hos laks, Buc1a, Buc1b, Buc2a og Buc2b, der Buc1b er et pseudogen som ikke uttrykkes. De tre aktive Buc-genene ble identifisert både som mRNA og protein i ovulerte og nybefruktede egg. Buc lokaliserer til strukturer under tidlig celledeling (celledelingsfuren) som indikerer at proteinet er involvert i etablering av kjønnscellelinjen hos laks. I tidlige stadier av ovarieutviklingen samlokaliserer Buc med flere andre proteiner involvert i kjønnscelleutvikling til en struktur i oocytten/egget kalt Balbiani legemet.
Basert på funn som er gjort i prosjektet er Buc en klar kandidat for å utvikle molekylærbiologiske og immunologiske metoder for produksjon av steril fisk.
Spesielt har man sett nærmere på Buc-proteinet som tidligere ikke har blitt karakterisert hos laks som har et tetraploid genom. Det ble funnet fire varianter av Buc-genet hos laks, Buc1a, Buc1b, Buc2a og Buc2b, der Buc1b er et pseudogen som ikke uttrykkes. De tre aktive Buc-genene ble identifisert både som mRNA og protein i ovulerte og nybefruktede egg. Buc lokaliserer til strukturer under tidlig celledeling (celledelingsfuren) som indikerer at proteinet er involvert i etablering av kjønnscellelinjen hos laks. I tidlige stadier av ovarieutviklingen samlokaliserer Buc med flere andre proteiner involvert i kjønnscelleutvikling til en struktur i oocytten/egget kalt Balbiani legemet.
Basert på funn som er gjort i prosjektet er Buc en klar kandidat for å utvikle molekylærbiologiske og immunologiske metoder for produksjon av steril fisk.
Steril laks er av mange ansett som et tiltak for å redusere mulige negative effekter av rømming av laks. Triploid, steril laks er tilgjengelig i markedet i dag, men fremdeles er det usikkert om denne kan produseres uten uheldige effekter på fiskevelferd (feilutvikling, sykdomsmotstand) og redusert prestasjon (dårligere tilvekst i sluttfasen). Bedre metoder for produksjon av steril laks vil derfor kunne være nyttige for næringen, også fordi redusert innslag av kjønnsmoden laks uten tap av tilvekst i sluttfasen i seg selv vil være attraktivt. Prosjektet er et (lite) skritt i retning av slik produksjon, men gir også ny og grunnleggende kunnskap om utvikling av laks i tidlige livsstadier.
-
Sluttrapport: Steril laks – kartlegging av faktorer sentrale i dannelse av kjønnsceller hos Atlantisk laks
Nofima. Rapport K-36/2015. Av Helge Tveiten (Nofima), Adrijana Skugor (Nofima), Øivind Andersen (Nofima), Krasimir Slanchev (Max-Planck Institute/Nofima), Maren Mommens (Aqua Gen) og Nina Santi (Aqua Gen).
Norge har gjennom internasjonale avtaler forpliktet seg til å ta et særlig forvalteransvar for villaksen. Et mulig alternativ for å redusere risiko for genetisk påvirkning fra rømt oppdrettslaks kan være å benytte steril oppdrettslaks.
I dag regnes triploidisering, dvs. at fisken får ett ekstra sett kromosomer, som den mest effektive metode for å sterilisere fisk i akvakultur. Bruk av metoden har hittil vist seg å kunne gi en økt frekvens av feilutvikling, og lavere toleranse for høye temperaturer.
Selv om triploid fisk kan komme til å spille en viktig rolle i lakseproduksjonen fremover, er det ønskelig å se på muligheten for å utvikle andre metoder for å hindre kjønnsmodning og reproduksjon hos laks i oppdrett.
I dag regnes triploidisering, dvs. at fisken får ett ekstra sett kromosomer, som den mest effektive metode for å sterilisere fisk i akvakultur. Bruk av metoden har hittil vist seg å kunne gi en økt frekvens av feilutvikling, og lavere toleranse for høye temperaturer.
Selv om triploid fisk kan komme til å spille en viktig rolle i lakseproduksjonen fremover, er det ønskelig å se på muligheten for å utvikle andre metoder for å hindre kjønnsmodning og reproduksjon hos laks i oppdrett.
Å skaffe kunnskap om lokalisering og mengde av spesifikke faktorer som er involvert i dannelsen av kjønnscellelinjen gjennom ulike faser av oocytt/ovarieutviklingen hos atlantisk laks.
Informasjonen som opparbeides vil legge grunnlag for å identifisere tidspunkt/faser hvor slike faktorer, både som protein og mRNA, er tilgjengelige for vaksinemediert immunonøytralisering og antisens blokkert proteintranslasjon. Slik informasjon er avgjørende for å utvikle nye og effektive steriliseringsmodeller og protokoller for laks.
Oppgave 1: Uttak av prøvemateriale
Uttak av ovarier gjennom ulike stadier av oogenesen vil bli gjennomført ved AquaGen sine anlegg eller ved Havbruksstasjonen i Tromsø. Prøvematerialet vil bli behandlet og preservert i forhold til bruk i uttrykksstudier (rt-PCR) og intercellulær lokalisering av mRNA (in situ hybridisering) og protein (immunohistokjemi). Uttakene vil bli gjort med utgangspunkt i stadieinndeling av oocytter definert for annen laksefisk. Uttakene vil representere ulike stadier av både juvenile og modnende ovarier.
Oppgave 2: Kloning og uttrykk av kandidatgener
Kandidatgener som er av spesiell interesse og som skal undersøkes i prosjektet er Vasa, Nanos, Dead end, Dazl og Buc. Nanos, Dead end og Vasa vil også bli gjenstand for undersøkelser i SalmoSterile. Første gangs karakterisering vil være avhengig av fremdriften i de ulike prosjektene, men når dette finner sted vil det fremkomme gjennom formidling og rapportering av de respektive prosjektene. Karakterisering og lokalisering av Buc vil være spesifikk for FHF-prosjektet.
Homologi kloning av disse genene vil bli gjennomført ved bruk av degenererte PCR primere. Full-lengde cDNA for de ulike genene vill bli opparbeidet ved hjelp av RACE (rapid-amplification of cDNA ends) ved bruk av kommersielle kit.
Opparbeidet sekvensinformasjon vil danne grunnlag for syntese av prober for in situ hybridisering. In situ hybridisering vil bli utført i h.h.t etablerte protokoller.
Oppgave 3: Antigen syntese og antistoff
Peptid konjugater: Basert på sekvensinformasjonen opparbeidet i Oppgave 1 vil ulike syntetiske peptider konjugeres til bæreprotein (peptidantigener) og formuleres til vaksine for videre immunisering av kanin hos en kommersiell leverandør.
Rekombinante proteiner: Basert på sekvensinformasjonen opparbeidet i Oppgave 1 vil utvalgte kloner danne grunnlag for rekombinant protein syntese “in house” eller hos en kommersiell tilbyder. Rekombinant protein vil bli renset og brukt som antigen for immunisering av kanin.
Oppgave 4: Western blot (WB) og Immunohistokjemi (IHC)
Sera fra kanin immunisert med de aktuelle proteinene (Oppgave 3) vil bli testet ved bruk av WB og videre brukt til intercellulær lokalisering av germplasm-proteiner ved bruk av IHC på fikserte oocytter i henhold til etablerte protokoller.
Oppgave 5: In vivo lokalisering av Buc-protein
Et plasmid konstrukt som skal danne grunnlag for syntese av et Buc-kimærisk mRNA med green fluorescent protein (GFP) vil bli produsert.
Buc visualiseres ved å injisere lakseembryo med buc-GFP mRNA i perioden rett etter befruktning. Ved bruk av fluorescensmikroskopi kan den intracellulære lokaliseringen av proteinet bestemmes.
Uttak av ovarier gjennom ulike stadier av oogenesen vil bli gjennomført ved AquaGen sine anlegg eller ved Havbruksstasjonen i Tromsø. Prøvematerialet vil bli behandlet og preservert i forhold til bruk i uttrykksstudier (rt-PCR) og intercellulær lokalisering av mRNA (in situ hybridisering) og protein (immunohistokjemi). Uttakene vil bli gjort med utgangspunkt i stadieinndeling av oocytter definert for annen laksefisk. Uttakene vil representere ulike stadier av både juvenile og modnende ovarier.
Oppgave 2: Kloning og uttrykk av kandidatgener
Kandidatgener som er av spesiell interesse og som skal undersøkes i prosjektet er Vasa, Nanos, Dead end, Dazl og Buc. Nanos, Dead end og Vasa vil også bli gjenstand for undersøkelser i SalmoSterile. Første gangs karakterisering vil være avhengig av fremdriften i de ulike prosjektene, men når dette finner sted vil det fremkomme gjennom formidling og rapportering av de respektive prosjektene. Karakterisering og lokalisering av Buc vil være spesifikk for FHF-prosjektet.
Homologi kloning av disse genene vil bli gjennomført ved bruk av degenererte PCR primere. Full-lengde cDNA for de ulike genene vill bli opparbeidet ved hjelp av RACE (rapid-amplification of cDNA ends) ved bruk av kommersielle kit.
Opparbeidet sekvensinformasjon vil danne grunnlag for syntese av prober for in situ hybridisering. In situ hybridisering vil bli utført i h.h.t etablerte protokoller.
Oppgave 3: Antigen syntese og antistoff
Peptid konjugater: Basert på sekvensinformasjonen opparbeidet i Oppgave 1 vil ulike syntetiske peptider konjugeres til bæreprotein (peptidantigener) og formuleres til vaksine for videre immunisering av kanin hos en kommersiell leverandør.
Rekombinante proteiner: Basert på sekvensinformasjonen opparbeidet i Oppgave 1 vil utvalgte kloner danne grunnlag for rekombinant protein syntese “in house” eller hos en kommersiell tilbyder. Rekombinant protein vil bli renset og brukt som antigen for immunisering av kanin.
Oppgave 4: Western blot (WB) og Immunohistokjemi (IHC)
Sera fra kanin immunisert med de aktuelle proteinene (Oppgave 3) vil bli testet ved bruk av WB og videre brukt til intercellulær lokalisering av germplasm-proteiner ved bruk av IHC på fikserte oocytter i henhold til etablerte protokoller.
Oppgave 5: In vivo lokalisering av Buc-protein
Et plasmid konstrukt som skal danne grunnlag for syntese av et Buc-kimærisk mRNA med green fluorescent protein (GFP) vil bli produsert.
Buc visualiseres ved å injisere lakseembryo med buc-GFP mRNA i perioden rett etter befruktning. Ved bruk av fluorescensmikroskopi kan den intracellulære lokaliseringen av proteinet bestemmes.
En forventer at prosjektet vil generere resultater som kan publiseres i internasjonale vitenskapelige journaler med fagfellevurdering. Resultatene vil bli presentert på FHF sine seminarer der steril fisk er tema. Resultatene vil bli presentert på en egnet konferanse nasjonalt eller internasjonalt.
-
Sluttrapport: Steril laks – kartlegging av faktorer sentrale i dannelse av kjønnsceller hos Atlantisk laks
Nofima. Rapport K-36/2015. Av Helge Tveiten (Nofima), Adrijana Skugor (Nofima), Øivind Andersen (Nofima), Krasimir Slanchev (Max-Planck Institute/Nofima), Maren Mommens (Aqua Gen) og Nina Santi (Aqua Gen).