Til innholdet

Isolering og karakterisering av Paramoeba perurans med vekt på fenotypisk og genetisk karakterisering av utvalgte kloner fra laks og andre verter

Sammendrag av resultater fra prosjektets faglige sluttrapport
Amøbisk gjellesykdom (AGD) forårsaket av Paramoeba perurans fremstod som et potensielt alvorlig problem for lakseoppdrett i Sør-Norge i 2013. Det første offisielle utbruddet ble registrert i Sogn og Fjordane i 2006. Denne parasitten kom i tillegg til en rekke andre årsaker til gjellesykdommer hos laks i oppdrett på Vestlandet. Selv om AGD var godt kjent fra lakseoppdrett i Tasmania førte den raske økningen i AGD-tilfeller, forårsaket av P. perurans, til et omfattende behov for ny kunnskap om denne parasitten. Dette førte til at laksenæringen i samarbeid med FHF ønsket igangsatt forskningsprosjekter for, om mulig, å fremskaffe nye strategier for å imøtegå problemet. Dette prosjektet hadde som mål å karakterisere (fenotypisk og genetisk) isolater av P. perurans for å fremskaffe nødvendige verktøy for studier av reservoar, spredning, historisk forekomst, identifisering av mulige virulensforskjeller, identifisering av virulensmarkører, temperaturtoleranse, salinitetstoleranse, og metoder for rask og sikker påvisning av parasitten.

Første steg i prosjektet var innhenting av isolater av P. perurans fra oppdrettslaks og utvalgte marine fisk fra fylker på Vestlandet og Trøndelag. Isolatene, som ble dyrket på agar og i flytende medier, ble klonet etter to passasjer, og de enkelte klonene ble benyttet til fenotypisk karakterisering, genetisk karakterisering, og i smittestudier for å klarlegge eventuelle virulensforskjeller. Resultatene fra prosjektet viser at det er betydelige forskjeller mellom isolater av P. perurans med henblikk på temperaturtoleranse, salinitetstoleranse, veksthastighet, produksjon av spredningsstadier, morfologi, og virulens. Prosjektet har også vist at de fleste isolater av P. perurans kan lagres på flytende nitrogen. Det har imidlertid ikke vært mulig å påvise genetiske forskjeller, som kan forklare virulensforskjeller og annen fenotypisk variasjon, mellom kloner av P. perurans fra forskjellige fiskeverter og fylker i Sør-Norge. Markører for studier av virulens og for spredningsstudier har ikke vært mulig å fremskaffe. Det kan ikke utelukkes at virulensvariasjon mellom kloner av P. perurans kan være et resultat av epigenetiske mekanismer (mekanismer som styrer om en egenskap kommer til uttrykk eller ikke) eller variasjon i mikrobiota på gjellene hos laks. De epigenetiske mekanismene kan tenkes utløst av ytre miljøfaktorer (salinitet, temperatur etc.), mikrobiota på gjellene hos laks, eller variasjon i vertsresponser. Studier av historisk materiale fra perioden 2003 til 2017 viste at P. perurans var til stede på Vestlandet så tidlig som i 2004. 

Basert på eksisterende data (manglende genetisk variasjon, nytt problem fra 2012) kan det synes som om P. perurans er relativt nylig introdusert til Norge, kanskje med ballastvann fra internasjonal båttrafikk? Variasjon i salinitetstoleranse medfører at bruk av ferskvann for fjerning av amøben må gjennomføres på en slik måte at en ikke selekterer for økt salinitetstoleranse. Variasjon i temperaturtoleranse tilsier at parasitten kanskje kan spre seg til lakseoppdrett også i Nordland fylke. Påvisning av P. perurans hos villfanget rensefisk (leppefisk og rognkjeks) tilsier at flytting av slik fisk utgjør en potensiell risiko for spredning. I fremtidige studier av virulensvariasjon må det fokuseres på mulig epigenetiske mekanismer og gjellemikrobiota i tillegg til videre detaljerte studier av genomet til P. perurans og den amøbe-lignende symbionten, Perkinsela sp.

Vitenskapelig publisering
– Are Nylund, Dario Pistone, Cristiane Trösse, Steffen Blindheim, Linda Andersen, and Heidrun Plarre, ‘Genotyping of Candidatus Syngnamydia salmonis (Chlamydiales; Simkaniaceae) co-cultured in Paramoeba perurans (Amoebozoa; Paramoebidae)’​,​ Arhives of Microbilogy, 200/6, Aug. 2018, 859​–​67. For an abstract and a free open-access article, see Springer Link at
<https://link.springer.com/article/10.1007/s00203-018-1488-0>.
–​
A. Steigen, A. Nylund, H. Plarre, K. Watanabe, E. Karlsbakk, and O. Brevik, Presence of selected pathogens on the gills of five wrasse species in western Norway. Diseases of Aquatic Organisms, 128 (2018), 21–35. An abstract and a free open-access article are available at
<https://www.int-res.com/abstracts/dao/v128/n1/p21-35/​>.
Prosjektet har gitt ny kunnskap om fenotypiske egenskaper til amøben som forårsaker AGD, samt forskjeller i virulens og en utredning av mulige faktorer som påvirker virulensforskjeller og annen fenotypisk variasjon mellom ulike kloner av amøben. Resultatene gir viktige implikasjoner for behandlingsstrategier og overvåkning av spredning i forhold til risiko for seleksjon av økt toleranse mot f.eks. salinitet. Det er også fremskaffet kunnskap og verktøy for studier av reservoar, spredning, historisk forekomst, temperaturtoleranse, salinitetstoleranse, og metoder for rask og sikker påvisning av parasitten.​
Et betydelig problem for produksjon av atlantisk laks i Norge har siden midten av 1990-tallet vært forekomst av gjellesykdommer. Hovedvekten av disse tilfellene har vært lokalisert til Vestlandet.

En rekke forskjellige patogener er knyttet til gjelleproblemer hos laks, og de siste to årene har flere anlegg hatt betydelige tap assosiert med tilstedeværelse av amøben Paramoeba perurans. Flere av disse anleggene har fått diagnosen amøbisk gjellesykdom (AGD – amoebic gill disease).

P. perurans forekommer i oppdrett av laksefisk i de fleste lakseproduserende land og ble først påvist i Norge i 2006, mens betydelige tap knyttet til denne parasitten i hovedsak ble registrert høsten 2013 og 2014 (>50 tilfeller i året). I tillegg til laksefisk har amøben vært påvist på flere marine arter som berggylt, rødnebb/blåstål, rognkjeks, sei og makrell. Det kan ikke utelukkes at alle disse artene kan være viktige for spredning av parasitten mellom oppdrettspopulasjoner, men det kan også være at det foreligger flere varianter av P. perurans hvor disse er tilpasset forskjellige marine fiskearter. ​

Foreløpige data fra innledende smitteforsøk indikerer at forskjellige kloner av P. perurans har forskjellig virulens i smitte på laks. Kunnskapen om denne parasitten i norske farvann er svært mangelfull med henblikk på variasjon mellom kloner, virulens, vertspreferanser, vekstbetingelser, naturlige reservoar, spredning, og toleranse for forskjellige terapeutiske behandlinger.
Å fremskaffe kunnskap om variasjon hos kloner av P. perurans fra laks i oppdrett og fra utvalgte villfisk-arter, etablere et system for nedfrysing av isolater, utvikle verktøy for studier av spredning, og fremskaffe virulensmarkører.

Delmål
A. Å foreta innsamling av isolater av Paramoeba spp. fra alle oppdrettsområder i Norge med AGD.
B. Å foreta fenotypisk karakterisering av klonede isolater av P. perurans.
C. Å optimalisere dyrkingsbetingelser med henblikk på nedfrysing og opptining av disse klonene. En vil i denne sammenheng prøve å fremprovosere dannelse av hvilestadier/cyster.
D. Å kartlegge vertstropisme og virulens hos utvalgte kloner fra laks og villfiskarter (rensefisk, sei etc) knyttet til oppdrett av laks (smitteforsøk).
E. Å kartlegge eventuell betydning av symbionter (bakterier, Perkinsela sp.) for variasjon av virulens hos P. perurans.
F. Å utvikle verktøy for genotyping av isolater av P. perurans.
G. Å kartlegge isolatvariasjon (vertsvariasjon, geografisk variasjon og variasjon i virulens) hos P. perurans fra lakseoppdrett og villfisk i nærheten av positive anlegg (bruk av verktøy for genotyping).
H. Å kartlegge prevalens av P. perurans i historisk materiale fra oppdrettslaks med gjellesykdommer (materiale lagret ved Universitetet i Bergen).
Gjellesykdommer er blant de mest tapsbringende faktorer i produksjon av laks og de siste to årene (2013–2014). AGD, assosiert med P. perurans, har påført næringen store tap.
 
Forebygging og behandling forutsetter at nødvendig kunnskap om denne amøben er tilgjengelig slik at korrekte og optimale tiltak kan gjennomføres. Forskning på amøben forutsetter at denne kan dyrkes og holdes i laboratorier gjennom hele året med moderate kostnader, og dette prosjektet skal etablere den nødvendige teknologien.

Prosjektet skal også fremskaffe kunnskap om variasjon mellom isolater av P. perurans, dvs. variasjon i virulens, vertstropisme og geografisk forekomst. Denne kunnskapen vil være nødvendig for at næringen skal kunne implementere nødvendige og målrettede tiltak for å forhindre fremtidig tap knyttet til amøbeinfeksjoner.
 
Prosjektet skal også utvikle diagnostikk som skal kunne skille mellom virulente og mindre virulente varianter av P. perurans slik at tiltak mot amøben vil være effektiv med en lavest mulig kostnad.
Prosjektet består av følgende arbeidspakker:

Arbeidspakke I: Fenotypisk karakterisering av amøbekloner og etablering av nedfrysningsmetode.

Arbeidspakke II: Smitteforsøk og cellekulturstudier for å kartlegge vertstropisme og virulens hos utvalgte kloner.

Arbeidspakke III: Fullgenomsekvensering av en virulent klon av P. perurans.

Arbeidspakke IV: Genotyping av kloner.

Arbeidspakke V: Kartegging av geografisk og historisk utbredelse, identifisering av virulensmarkører, og variasjon hos isolater fra oppdrett og villfisk.

Arbeidspakke VI: Utvikling av real time (sanntids) polymerasekjedereaksjon (RT PCR) for rask og sikker identifisering av arter (Paramoeba spp) og virulente kloner av P. perurans.

Resultater fra alle avsluttede milepæler vil bli gjort tilgjengelig for næring og forvaltning via presentasjoner på fagmøter og i fagtidsskrifter.
Brukere av kunnskapen som fremkommer i prosjektet er oppdrettsindustrien, Mattilsynet, og nasjonale og internasjonale forskningsgrupper.

Resultatene fra arbeidspakkene vil bli presentert på møter organisert av FHF, nasjonale og internasjonale konferanser og symposier. Videre vil resultatene bli gjort tilgjengelig i norske tidsskrifter rettet mot næring og forvaltning. Viktig ny kunnskap med spesiell interesse for oppdrettsnæringen vil også bli publisert fortløpende som populærvitenskapelige artikler i Norsk Fiskeoppdrett.

Sluttrapporten gjøres tilgjengelig på FHFs nettsider.

Alle resultater av vitenskapelig interesse vil også bli publisert i internasjonale tidsskrifter og presentert på internasjonale vitenskapelig konferanser.
keyboard_arrow_up