Prosjektnummer
901860
Tracing lice using epigenetic markers (TraceLice)
Markører i genomet til lakselus er identifisert, som gjør at opphav til luselarver kan identifiseres og som øker kunnskapen om spredning av lus
• Det er signifikante forskjeller i DNA-metyleringsmønsteret og genuttrykket mellom lus samlet fra oppdrettslaks, sjøørret og røye.
• Selv om forskjellene ved de spesifikke posisjonene er signifikante på gruppenivået, er ingen av forskjellene entydige når man ser på individuelle lus. Bruk av flere markører kunne muligens løse dette problemet.
• En MS-qPCR-assay, en assay som kan skille metyleringsraten ved en spesifikk posisjon, ble utviklet for en posisjon som ble funnet å ha forskjellig metyleringsrate i lus fra oppdrettslaks sammenlignet med lus fra sjøørret eller røye.
• Metyleringsraten målt med assayen viste signifikante forskjeller både i voksne hunnlus og i deres avkom, men under forholdene var den ikke sensitiv nok til å måle metyleringsraten i enkelte kopepoditter.
• Selv om forskjellene ved de spesifikke posisjonene er signifikante på gruppenivået, er ingen av forskjellene entydige når man ser på individuelle lus. Bruk av flere markører kunne muligens løse dette problemet.
• En MS-qPCR-assay, en assay som kan skille metyleringsraten ved en spesifikk posisjon, ble utviklet for en posisjon som ble funnet å ha forskjellig metyleringsrate i lus fra oppdrettslaks sammenlignet med lus fra sjøørret eller røye.
• Metyleringsraten målt med assayen viste signifikante forskjeller både i voksne hunnlus og i deres avkom, men under forholdene var den ikke sensitiv nok til å måle metyleringsraten i enkelte kopepoditter.
Sammendrag av resultater fra prosjektets faglige sluttrapport (English summary further below)
Lakselusen er en parasitt som er spesialisert på laksefisker og alle laksearter som finnes langs norskekysten, nemlig atlantisk laks (oppdretts- og villaks), pukkellaks, sjøørret og røye kan være verter for lakselusen og kan dermed være mulige smittekilder for luselarver. Luselarver spres med strømmen og spredningen kan modelleres ved å bruke hydrodynamiske-biologiske modeller, men eksperimentell sporing av kopepoditter tilbake til deres vert er foreløpig ikke mulig, og modellering er ikke i stand til å skille mellom kopepoditter som stammer fra oppdretts- eller villfisk i et gitt område. En mulighet for å finne ut hvor parasittene stammer fra er å bruke spesifikke markører som kan skille kopepoditter fra de forskjellige artene eller skille mellom villfisk og oppdrett. Metoden må være pålitelig og relativt lett å måle.
Målet med dette prosjektet var å identifisere epigenetiske markører i genomet til lakselusen som gir informasjon om kopepodittens opprinnelse. DNA-metylering er en epigenetisk mekanisme, som kan gi varige endringer i genuttrykk som ikke kan tilskrives endringer i DNA-sekvensen og kan være påvirket av miljø. Der er forskjellige måter å måle epigenetiske endringer. En mulighet er å måle metylering ved kjente spesifikke posisjoner i genomet med sensitive metyleringsspesifikke (MS)-qPCR-assayer.
For å finne signifikante spesifikke forskjeller i metyleringsmønsteret i dette prosjektet ble voksne hunnlakselus fra forskjellige verter langs norskekysten samlet inn og studert. DNA-metyleringsmønstre ble studert ved hjelp av sekvensering av DNA fra disse lusene og analysert for konsistente forskjeller mellom grupper av lus samlet fra forskjellige verter. Av de samme lusene ble også genuttrykksmønstrene undersøkt med hjelp av RNA-sekvensering. Ved å analysere samspill med DNA-metyleringsmønstre og genuttrykket skulle påliteligheten til markørene identifisert ved DNA-sekvenseringen evalueres. Voksne hunnlus ble funnet på alle vertsarter, men i forskjellig antall. Analysene ble derfor konsentrert om lus fra artene sjøørret, røye og oppdrettslaks. Et viktig resultat
her er at metyleringsraten av lakselusgenomet viste seg å være veldig lav i forhold til vertebrater. Lav metyleringsrate har også vært vist for andre evertebrater. Det ble funnet flere genomiske regioner som viste signifikant forskjellig metyleringsrate når man sammenlignet lus fra sjøørret og lus fra røye med lus fra oppdrettslaks. Disse lusene viste også signifikant forskjellig genuttrykk.
Ingen epigenetisk enkeltmarkør kunne entydig skille mellom lus fra forskjellige verter, noe som muligens kunne løses ved å bruke flere markører i kombinasjon. En epigenetisk assay (MS-qPCR) ble utviklet for en av markørene som viste signifikant forskjell. Den ble testet på nye lus samplet fra sjøørret og oppdrettslaks i etterfølgende år og på deres avkom. Metyleringsraten ved denne epimarkøren var signifikant forskjellig i voksne hunnlus fra oppdrettslaks sammenlignet med lus fra sjøørret. Resultatene viser, at metyleringsmønsteret for denne epimarkøren var koblet til vertsarten. Selv om resultatet var signifikant var det ikke entydig når man så på hver enkelt lus, noe som viste behovet for flere assayer som samlet kunne gitt et entydig resultat. Samme assay ble brukt til å undersøke metyleringsmønsteret i avkom til nye innsamlede voksne hunnlus. Resultatene viste at det også var en signifikant forskjell i metyleringsraten for denne epimarkøren i kopepodittene. Sensitiviteten av metoden var dessverre ikke god nok til å undersøke enkelte kopepoditter og kunne bare brukes til bulk målinger når det ble brukt mange kopepoditter fra samme eggstreng (søsken). Videre optimalisering av målemetoden ville muligens kunne hjelpe.
Resultatene til TraceLice viser, at det er potensielt mulig å kartlegge opprinnelsen av lakselus med hensyn til vertsarten med hjelp av epigenetiske markører. For å kunne bruke epimarkører som analysemetode ville det kreve bruk av flere markører og optimalisering av målemetoden til bruk på enkelte kopepoditter. Ytterligere markører kan finnes ved hjelp av dataene produsert i TraceLice-prosjektet.
Summary of results from the project’s final reporting
The salmon louse is a specialist on salmonid fish. All salmonid species found along the Norwegian coast, namely Atlantic salmon (farmed and wild salmon), pink salmon, sea trout, and Arctic char, can acts as hosts for the salmon louse and thus potentially be a source of infective louse larvae. Larvae are transported with the currents and the spread can be predicted using coupled hydrodynamic-biological models, but experimental tracking of copepodids back to their host is currently not possible, and modelling is unable to distinguish between copepodids originating from farmed or wild fish in a given area. To determine origin of larvae, specific markers are needed that can distinguish between copepodids from different hosts. These markers must be reliable and easy to measure.
The aim of this project was to identify epigenetic markers in the genome of the salmon louse that provide information about the origin of the copepodids. DNA methylation is one of the main mechanisms in epigenetics, resulting in heritable changes in gene expression that cannot be attributed to changes in the DNA sequence and can be influenced by the environment. Epigenetic changes at known specific positions in the genome can be measured with sensitive MS-qPCR assays.
To find specific significant differences in methylation patterns, adult female salmon lice from different hosts were collected along the Norwegian coast in this project. DNA methylation patterns were investigated using Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) of these lice and analysis for consistent differences between groups of lice collected from different hosts. The same lice were also investigated for gene expression patterns using RNA sequencing. By analysing the connection between DNA methylation patterns and gene expression, the reliability of the markers identified by DNA sequencing was evaluated. Adult female lice were found on all host species, but in different numbers. Therefore, the analyses were concentrated on lice from the sea trout, Arctic char, and farmed salmon, where sufficient lice numbers were available. An important result here is that the methylation rate of the salmon louse genome turned out to be very low compared to vertebrates. Low methylation rates have also been shown for other invertebrates. Although the methylation rate of the salmon louse genome was low, several regions showed significantly different methylation rates when comparing lice from sea trout or Arctic char with lice from farmed salmon, which also showed significantly different gene expression.
No single epigenetic marker could unambiguously distinguish between lice sampled from different hosts, which could possibly be solved by using several markers in combination. An epigenetic assay (MS-qPCR) was developed for one of the markers that showed significant difference. It was tested on new lice sampled from sea trout and farmed salmon in subsequent years and on their offspring. The methylation rate at this epimarker was significantly different in adult female lice from farmed salmon compared to adult female lice from sea trout. The results show that the methylation pattern of this epimarker was linked to the host species. Although the result was significant, it was not unambiguous when looking at each individual lice, which showed the need for multiple assays that together could have given an unambiguous result. The same assay was used to examine the methylation pattern in the offspring of newly collected adult female lice. The results showed that there was also a significant difference in the methylation rate of this epimarker in the copepodites. Unfortunately, the sensitivity of the method was not good enough to examine individual copepodites and could only be used for bulk measurements when many copepodites from the same egg string (siblings) were used. Further optimization of the measurement method could possibly help.
The results of TraceLice show that it is potentially possible to map the origin of sea lice with respect to the host species using epigenetic markers. To be able to use use epimarkers as an analytical method would require the use of multiple markers and optimization of the measurement method for use on individual copepodites. Additional markers can be found using the data produced in the TraceLice project.
Resultatene fra prosjektet viser at det faktisk er mulig å analysere om en luselarve kommer fra en oppdrettsfisk eller villfisk. Dette bør benyttes for å øke kunnskapen om hvordan lus sprer seg, og kan inngå som en del av nødvendig validering av lusespredningsmodellene. Det er også mulig at metodene kan utvikles slik at man kan analysere om lusesmitte kommer fra eget anlegg, fra andre anlegg som benytter annet fôr, eller kommer fra lus som utviklet seg på villfisk.
-
Sluttrapport: TraceLice – Sporing av lus ved hjelp av epigenetiske markører
Havforskningsinstituttet (HI). Rapport fra havforskningen 2025-12. 27. februar 2025. Av Christiane Eichner (Universitetet i Bergen), Rasmus Skern (HI), Takaya Saito (HI), Kai Ove Skaftnesmo (HI), Kaja Skjærven (HI) og Sussie Dalvin (HI).
Lakselus (Lepeophtheirus salmonis) har en høy reproduksjonsrate. Lakselusegg festes til kroppen til
hunnlusen inntil larvene klekkes. Disse spres med havstrømmer og ved å
bruke hydrodynamisk-biologiske modeller kan spredningen av luselarver
forutsies. Men, eksperimentell sporing av kopepoditter tilbake til deres
opprinnelse er imidlertid foreløpig ikke mulig, og modellering er ikke i
stand til å skille mellom kopepoditter som stammer fra oppdrettsfisk eller
fra villfisk i et gitt område.
Spesielt sjøørret som kan oppholde seg i kystområdene i flere måneder
eller til og med år, kan være infisert av store mengder voksne hunnlus og
kan derfor bidra med å spre infektive kopepoditter. En annen kilde kan
være tilbakevandrende villaks. I denne sammenheng er bestanden av
pukkellaks, en stillehavsart som har invadert Norge de siste årene,
spesielt interessant, ettersom den forventes å være langt større enn
bestanden av vill atlanterhavslaks. Dermed kan pukkellaksen bli en
betydelig kilde til kopepoditter.
Hovedmål
Å identifisere epigenetiske markører i genomet til lakselus som gir pålitelig informasjon om kopepoditters opprinnelse.
Delmål
1. Å identifisere vertsspesifikke markører. Dette gjøres ved å investigere DNA-metyleringsmønstre ved hjelp av sekvensering av voksne hunnlus fra ulike verter og analysere disse for konsistente forskjeller.
2. Å evaluere påliteligheten til markørene identifisert i delmål 1 ved å analysere deres samspill med genuttrykket av relevante gener. Dette gjøres ved å RNA-sekvensere lusene og så innlemme de resulterende genuttrykksmønstrene med DNA-metyleringsdataene for å evaluere epimetyleringsmarkørene identifisert i delmål 1.
3. Å utvikle og teste assayer som identifiserer opprinnelsen til kopepoditter. For å gjøre dette skal det utvikles metyleringsspesifikke qPCR-assayer (MS-qPCR) rettet mot epimetyleringsmarkørene identifisert i delmål 1.
Å identifisere epigenetiske markører i genomet til lakselus som gir pålitelig informasjon om kopepoditters opprinnelse.
Delmål
1. Å identifisere vertsspesifikke markører. Dette gjøres ved å investigere DNA-metyleringsmønstre ved hjelp av sekvensering av voksne hunnlus fra ulike verter og analysere disse for konsistente forskjeller.
2. Å evaluere påliteligheten til markørene identifisert i delmål 1 ved å analysere deres samspill med genuttrykket av relevante gener. Dette gjøres ved å RNA-sekvensere lusene og så innlemme de resulterende genuttrykksmønstrene med DNA-metyleringsdataene for å evaluere epimetyleringsmarkørene identifisert i delmål 1.
3. Å utvikle og teste assayer som identifiserer opprinnelsen til kopepoditter. For å gjøre dette skal det utvikles metyleringsspesifikke qPCR-assayer (MS-qPCR) rettet mot epimetyleringsmarkørene identifisert i delmål 1.
Lakselusen er den største enkeltutfordringen for norsk oppdrettsnæring;
den fører til reduksjon i industriell vekst og til både direkte og indirekte
kostnader knyttet til tiltak for bekjempelse av lakselus. Lusekontroll er
derfor av stor betydning. Et uunnværlig element i bekjempelsen av
lakselus er å forebygge nye angrep, noe som avhenger av at man kjenner
kilden til de infektive lakselus-kopepodittene. Dessverre er det per i dag
ikke mulig å bestemme kilden til lus eller deres kopepoditter. Dette prosjektet tar sikte på å utvikle et verktøy for å knytte kopepoditter som har smittet
fisken til deres opprinnelse.
Aktiviteten i prosjektet er inndelt i fire faglig arbeidspakker (AP-er) som hver
danner grunnlag for den neste basert på oppnåelse av milepæler (MP-er). I sum skal arbeidspakkene føre til utviklingen av en assay som kan brukes
til å skille mellom lus av forskjellig vertsopprinnelse.
AP1: Prøvetaking av lus
Denne AP-en er ledet og gjennomført av Havforskningsinstituttet (HI). Den danner grunnlaget for alle analyser med å skaffe lus av forskjellig opprinnelse. Innsamling av voksne hunnlus og eggstrenger med forskjellig vertsopprinnelse gjøres i forbindelse med HIs luseovervåkingsprogram langs norskekysten og i forbindelse med vitenskapelig undersøkelsestrål. I første samplingsperioden blir voksne hunnlus samplet til analyse gjennom AP2 og AP3, i andre samplingsperioden i tillegg eggstrenger, som klekkes ved laboratoriet for analyse av kopepoditter i AP4.
MP: Skaffe både voksne hunnlus og kopepoditter av forskjellig opprinnelse.
AP2: Bestemmelse av differensielt metylerte regioner
I denne AP-en ledet og gjennomført av HI skal med hjelp av “Reduced representation bisulfite sequencing” (RRBS) av voksne hunnlus, fra forskjellige verter og regioner, DNA-metyleringen kartlegges. Basert på sekvensdataene vil en differensiell metylert genanalyse bli gjort for å identifisere regioner som er forskjellig metylert mellom gruppene av lus.
MP: Kartlegge differensielt metylerte steder mellom vill og oppdrettet laksefisk som startpunktet for implementeringen av en MS-qPCR-analyse.
AP3: RNA-sekvensering
I denne AP-en ledet og gjennomført av Universitetet i Bergen (UiB) skal de samme lusene som blir undersøkt i AP2 RNA sekvenseres. En integrert analyse av RNA-uttrykningsmønstre med DNA-metyleringsdata oppnådd i AP2 vil gi et innblikk i hvilke gener som påvirkes av differensiell metylering.
MP: Påliteligheten til markørene identifisert i AP2 skal evalueres ved å analysere deres assosiasjon med uttrykk av relevante gener. Bare i tilfelle vellykket identifikasjon av differensielt metylerte steder mellom lusene fra forskjellig opprinnelse kan AP4 implementeres.
AP4: Implementering av en MS-qPCR-assay for undersøkelse av utvalgte metyleringssteder av interesse
I denne AP-en ledet og gjennomført av HI skal en metyleringsspesifikk qPCR (MS-qPCR)-assay etableres for å undersøke og validere DNA-metyleringsendringene i spesifikke gener eller genregioner oppdaget i voksne hunnlus i AP2 og AP3 for bruk i kopepoditter. MS-qPCR kan gi en kvantitativ vurdering av DNA-metyleringsendringer på spesifikke steder i et gitt gen. Dens anvendelse for å påvise metyleringstilstanden på disse spesifikke stedene vil bli testet i ytterligere voksne hunnlus tatt ut sommeren 2024 (AP1) og til slutt i kopepoditter klekket fra eggstrenger av disse lusene.
MP: MS-qPCR-assay for å undersøke metyleringsstatus i spesifikke gener som ble funnet i AP2 og AP3 til å kunne diskriminere mellom lus fra forskjellig opprinnelse.
AP1: Prøvetaking av lus
Denne AP-en er ledet og gjennomført av Havforskningsinstituttet (HI). Den danner grunnlaget for alle analyser med å skaffe lus av forskjellig opprinnelse. Innsamling av voksne hunnlus og eggstrenger med forskjellig vertsopprinnelse gjøres i forbindelse med HIs luseovervåkingsprogram langs norskekysten og i forbindelse med vitenskapelig undersøkelsestrål. I første samplingsperioden blir voksne hunnlus samplet til analyse gjennom AP2 og AP3, i andre samplingsperioden i tillegg eggstrenger, som klekkes ved laboratoriet for analyse av kopepoditter i AP4.
MP: Skaffe både voksne hunnlus og kopepoditter av forskjellig opprinnelse.
AP2: Bestemmelse av differensielt metylerte regioner
I denne AP-en ledet og gjennomført av HI skal med hjelp av “Reduced representation bisulfite sequencing” (RRBS) av voksne hunnlus, fra forskjellige verter og regioner, DNA-metyleringen kartlegges. Basert på sekvensdataene vil en differensiell metylert genanalyse bli gjort for å identifisere regioner som er forskjellig metylert mellom gruppene av lus.
MP: Kartlegge differensielt metylerte steder mellom vill og oppdrettet laksefisk som startpunktet for implementeringen av en MS-qPCR-analyse.
AP3: RNA-sekvensering
I denne AP-en ledet og gjennomført av Universitetet i Bergen (UiB) skal de samme lusene som blir undersøkt i AP2 RNA sekvenseres. En integrert analyse av RNA-uttrykningsmønstre med DNA-metyleringsdata oppnådd i AP2 vil gi et innblikk i hvilke gener som påvirkes av differensiell metylering.
MP: Påliteligheten til markørene identifisert i AP2 skal evalueres ved å analysere deres assosiasjon med uttrykk av relevante gener. Bare i tilfelle vellykket identifikasjon av differensielt metylerte steder mellom lusene fra forskjellig opprinnelse kan AP4 implementeres.
AP4: Implementering av en MS-qPCR-assay for undersøkelse av utvalgte metyleringssteder av interesse
I denne AP-en ledet og gjennomført av HI skal en metyleringsspesifikk qPCR (MS-qPCR)-assay etableres for å undersøke og validere DNA-metyleringsendringene i spesifikke gener eller genregioner oppdaget i voksne hunnlus i AP2 og AP3 for bruk i kopepoditter. MS-qPCR kan gi en kvantitativ vurdering av DNA-metyleringsendringer på spesifikke steder i et gitt gen. Dens anvendelse for å påvise metyleringstilstanden på disse spesifikke stedene vil bli testet i ytterligere voksne hunnlus tatt ut sommeren 2024 (AP1) og til slutt i kopepoditter klekket fra eggstrenger av disse lusene.
MP: MS-qPCR-assay for å undersøke metyleringsstatus i spesifikke gener som ble funnet i AP2 og AP3 til å kunne diskriminere mellom lus fra forskjellig opprinnelse.
Resultatene fra prosjektet skal presenteres i form av en faglig sluttrapport, samt gjennom en populærvitenskapelig publikasjon. Vitenskapelig formidling av data skal være gjennom presentasjon av resultatene på en internasjonal og en nasjonal konferanse.
-
Sluttrapport: TraceLice – Sporing av lus ved hjelp av epigenetiske markører
Havforskningsinstituttet (HI). Rapport fra havforskningen 2025-12. 27. februar 2025. Av Christiane Eichner (Universitetet i Bergen), Rasmus Skern (HI), Takaya Saito (HI), Kai Ove Skaftnesmo (HI), Kaja Skjærven (HI) og Sussie Dalvin (HI).