Prosjektnummer
901508
Fluorolice: Rapid fluorescence based identification of sea lice larvae in plankton samples
Testet og evaluert metodikk for deteksjon av luselarver som vil være et bidrag til kontroll med lakselus
• Prosjektet har etablert fluorescensmikroskopibasert metodikk som øker antall planktonprøver som kan analyseres for luselarver med en faktor på 10 sammenlignet med tradisjonell metodikk.
• Metodikken forutsetter at prøvene er formalinfikserte og at mikroskopet som anvendes har jevn belysning og den korrekte filtersammensetning.
• Videreutvikling av tilnærmingen bør omfatte utvikling av prøvetakingsutstyr og med fordel også algoritmebasert prøveanalyse.
Main findings
• Metodikken forutsetter at prøvene er formalinfikserte og at mikroskopet som anvendes har jevn belysning og den korrekte filtersammensetning.
• Videreutvikling av tilnærmingen bør omfatte utvikling av prøvetakingsutstyr og med fordel også algoritmebasert prøveanalyse.
Main findings
• The Fluorolice project has established a microscopy based methodology that increase the number of samples that can be analyzed for salmon louse larvae by a factor of 10 compared to traditional microscopy.
• The developed protocols require formalin-fixation of samples and access to fluorescence microscopes with very even stage illumination as well as the appropriate filters.
• The developed protocols require formalin-fixation of samples and access to fluorescence microscopes with very even stage illumination as well as the appropriate filters.
• Future development of the methodology should include automated and standardized sampling equipment and optionally methodology or automated sample analysis.
Sammendrag av resultater fra prosjektets faglige sluttrapport (Summary in English further below)
Lakselusinfeksjonspresset estimeres i dag gjennom en tverrdisiplinær innsats som inkluderer data fra tellinger på anlegg, lusespredningsmodellering, telling av lakselus på villfisk og telling av lus på fisk i fast plasserte overvåkingsbur. Alle disse observasjoner er imidlertid indirekte på den måten at de observerer antall luselarver på fisk og ikke det faktiske antall lakselus i sjøen. Direkte estimater forutsetter telling av lakseluslarver i vannsøylen. Dessverre er direkte telling med tradisjonell metodikk så ressurskrevende at det ikke er gjennomførbart for overvåking.
Det er tidligere uttestet et antall alternative tellingsmetoder: kvantitativ PCR (polymerasekjedereaksjon), eDNA-analyse, kvantitativ fraksjons-PCR og billedanalyse med FlowCam. De molekylærbiologiske metodene synes å være noe følsomme for variabilitet imellom prøver og krever derfor omfattende validering mens resultatene fra FlowCam var for upresise den lave forekomst av luselarver tatt i betraktning. Fluorescens mikroskopering ble foreslått som en mulig løsning 2017, men metodikken som opprinnelig ble presentert ga variable resultater som indikerte at ytterligere metodeutvikling var nødvendig. Fluorolice-prosjektet ble derfor igangsatt for å kartlegge lakselusens fluorescensprofil, og denne profilens avhengighet av parametere som alder, behandling.
I prosjektet ble det undersøkt om lakselusprofilen overlapper med andre planktonorganismer og løsninger for videreutvikling og automatisering ble sondert. Fluorolice-prosjektet identifiserte det mest lovende fluoresenssignal til å ha en eksitasjonsbølgelengde på 470 ± 40 nm og en fluorescensbølgelengde på 525 ± 50 nm. Det praktiske arbeidet viste at det var svært viktig å ha jevn og kraftig belysning av hele det synlige feltet.
Prosjektet viste videre at levende lakseluslarver hadde meget svak fluorescens mens spritpreserverte prøver hadde meget variabel fluorescens. Fluorescens synes derfor ikke å være umiddelbart anvendelig på ferske og levende prøver. Formalinfiksering av lakseluslarver medførte et sterkt og spesifikt fluorescenssignal som var fraværende i de fleste andre planktonorganismer. Imidlertid var det en overlapp med fluoresensprofilen til enkelte andre planktonarter, og det er derfor nødvendig å kombinere fluorescens med morfologi. Tester indikerer imidlertid at å bruke fluorescens reduserer tidsbruk ved telling og identifisering med en faktor på ca. 10. Tentative tester indikerte at det er mulig å prosessere prøver automatisk, men videreutvikling av denne tilnærmingen forutsetter analyse av tusenvis av bilder og var ikke mulig å gjennomføre under prosjektet.
Fluoroliceprosjektet har dokumentert lett gjennomførlig metodikk for hurtig analyse av planktonprøver, men metodikken forutsetter tilgang på spesialisert utstyr. Rutinemessig bruk av metoden for å tilveiebringe lett sammenliknelige data forutsetter tilgang til opparbeidingsfasiliteter, standardisert prøvetaking og en videreutvikling bør muligvis suppleres av utvikling av metodikk for automatisk prosessering.
Lakselusinfeksjonspresset estimeres i dag gjennom en tverrdisiplinær innsats som inkluderer data fra tellinger på anlegg, lusespredningsmodellering, telling av lakselus på villfisk og telling av lus på fisk i fast plasserte overvåkingsbur. Alle disse observasjoner er imidlertid indirekte på den måten at de observerer antall luselarver på fisk og ikke det faktiske antall lakselus i sjøen. Direkte estimater forutsetter telling av lakseluslarver i vannsøylen. Dessverre er direkte telling med tradisjonell metodikk så ressurskrevende at det ikke er gjennomførbart for overvåking.
Det er tidligere uttestet et antall alternative tellingsmetoder: kvantitativ PCR (polymerasekjedereaksjon), eDNA-analyse, kvantitativ fraksjons-PCR og billedanalyse med FlowCam. De molekylærbiologiske metodene synes å være noe følsomme for variabilitet imellom prøver og krever derfor omfattende validering mens resultatene fra FlowCam var for upresise den lave forekomst av luselarver tatt i betraktning. Fluorescens mikroskopering ble foreslått som en mulig løsning 2017, men metodikken som opprinnelig ble presentert ga variable resultater som indikerte at ytterligere metodeutvikling var nødvendig. Fluorolice-prosjektet ble derfor igangsatt for å kartlegge lakselusens fluorescensprofil, og denne profilens avhengighet av parametere som alder, behandling.
I prosjektet ble det undersøkt om lakselusprofilen overlapper med andre planktonorganismer og løsninger for videreutvikling og automatisering ble sondert. Fluorolice-prosjektet identifiserte det mest lovende fluoresenssignal til å ha en eksitasjonsbølgelengde på 470 ± 40 nm og en fluorescensbølgelengde på 525 ± 50 nm. Det praktiske arbeidet viste at det var svært viktig å ha jevn og kraftig belysning av hele det synlige feltet.
Prosjektet viste videre at levende lakseluslarver hadde meget svak fluorescens mens spritpreserverte prøver hadde meget variabel fluorescens. Fluorescens synes derfor ikke å være umiddelbart anvendelig på ferske og levende prøver. Formalinfiksering av lakseluslarver medførte et sterkt og spesifikt fluorescenssignal som var fraværende i de fleste andre planktonorganismer. Imidlertid var det en overlapp med fluoresensprofilen til enkelte andre planktonarter, og det er derfor nødvendig å kombinere fluorescens med morfologi. Tester indikerer imidlertid at å bruke fluorescens reduserer tidsbruk ved telling og identifisering med en faktor på ca. 10. Tentative tester indikerte at det er mulig å prosessere prøver automatisk, men videreutvikling av denne tilnærmingen forutsetter analyse av tusenvis av bilder og var ikke mulig å gjennomføre under prosjektet.
Fluoroliceprosjektet har dokumentert lett gjennomførlig metodikk for hurtig analyse av planktonprøver, men metodikken forutsetter tilgang på spesialisert utstyr. Rutinemessig bruk av metoden for å tilveiebringe lett sammenliknelige data forutsetter tilgang til opparbeidingsfasiliteter, standardisert prøvetaking og en videreutvikling bør muligvis suppleres av utvikling av metodikk for automatisk prosessering.
Summary of results from the project’s final reporting
Presently the most accurate estimates of infestation pressure is acquired through a multidisciplinary effort that includes lice counts from the aquaculture industry, modelling of sea lice production and dispersal, surveillance of salmon lice on wild salmonids and measuring infection levels on fish in sentinel cages. However, these data are all indirect in that they observe lice on fish and not the lice larvae actually present in the plankton. Identifying and enumerating salmon lice larvae in plankton is the only way to obtain direct measures. Alas, enumeration and identification by traditional methodology is too resource demanding for routine application and there have therefore been a number of efforts to develop more efficient methodologies including; quantitative real-time PCR, eDNA analysis, quantitative fraction PCR and automated image analysis (FlowCam). The molecular methodologies suffer from being vulnerable to variability between samples and therefore requiring extensive validation while automated image analysis methods previously tested were too imprecise for the purpose. Fluorescence microscopy was suggested as a solution in 2017, but the presented methodology yielded variable results indicating that further development was needed.
The Fluorolice project was designed to develop the methodology by investigating the salmon louse fluorescence profiles and their dependence
on treatments, age etc. Flourolice would furthermore investigate the fluorescence profile with respect to other zooplankton organisms and explore the possibilities for further development and automatization of sample processing. The project identified the most promising fluorescence peak to be at an excitation wavelength of 470 ± 40 nm and an emission wavelength of 525 ± 50 nm and it was found that illumination was required to be even across the entire field of view. The fluorescence was found to be weak in unpreserved samples and to be variable in samples stored on ethanol. This indicate that live fluorescence will not be readily applicable to live samples. Formalin fixation, in contrast yielded strong and specific fluorescence that did not overlap with most other plankton species. A few species did overlap, however, and it is therefore necessary to consider also morphology in identification. Tests indicated that the processing speed for plankton samples can be increased by a factor of 10 in manual sample processing. Preliminary tests suggested that automated identification should be possible as well, but the development of this requires algorithms trained on a very large number of pictures which was beyond the reach of the present project.
While the results enable much faster processing of plankton samples, widespread implementation of the methodology requires standardized sampling of large volumes and optional development of algorism for sample analyses.
Muligheten for å tidoble hastigheten ved registrering av luselarver i planktonprøver er spennende og kan bli viktig som verktøy for validering av spredningsmodeller for lakselus, og kanskje også bidra til mulig sporing av hvor luselarver kommer fra. Treffsikre modeller og kunnskap om hvordan luselarver spres i sjøen er viktig kunnskap for næringen når strategier for kontroll med lakselus utarbeides og tas i bruk. Metoden kan også være mulig å benytte for å kartlegge forekomst av luselarver på nye lokaliteter før de eventuelt tas i bruk.
-
Final report: FLUOROLICE
Institute of Marine Research (IMR). Report no. 2021-30. By Rasmus Skern (IMR), Cameron Thompson (IMR), Sussie Dalvin (IMR), Anders Thorsen (IMR), Samantha Bui (IMR), Gunnvør á Norði (Fiskaaling), James E. Bron (University of Stirling), and Mark Fordyce (Marine Scotland Science/ Aberdeen Marine Laboratory).
-
Scientific article: Illuminating the planktonic stages of salmon lice: A unique fluorescence signal for rapid identification of a rare copepod in zooplankton assemblages
Article in Journal of Fish Diseases 2021;00, 1–17. By Cameron R. S. Thompson et al.
Identifikasjon og kvantifisering av lakselus i de frie vannmasser er vanskelig og tidkrevende fordi luselarver, selv ved meget høye tettheter, er fåtallige i forhold til andre organismer i vannsøylen. Da tallfesting av lakseluslarver er ønskelig, både operasjonelt i industrien og for forbedret overvåking, har det gjennom lang tid blitt gjort bestrebelser på å utvikle metoder for larveidentifikasjon, uten at dette så langt har resultert i etablert utstyr for dette. Imidlertid har arbeid, først ved Marine Science Scotland og siden ved Havforskningsinstituttet, avdekket at lakseluslarver har et autofluorecensmønster som avviker fra de fleste, muligvis alle andre planktonorganismer. Dette er et trekk som egner seg for bruk i automatisert gjenkjenning av lakseluslarver.
Å karakterisere luselarvers fluorescens og generere protokoller for å kunne bruke fluorescensprofilen for raskere opparbeiding av planktonprøver.
Raskere og sikrere kvantifisering av luselarver i fri vannmasser vil kunne bidra til overvåking og varsling av risiko for lakselusinfestasjon, gi informasjon som grunnlag for å vurdere hvilke forebyggende tiltak som er best egnet, og vil kunne brukes direkte for validering av matematiske lusespredningsmodeller.
Prosjektet består av tre arbeidspakker (WP-er):
WP1: Kartlegging av fluorescens i lakselus og bakgrunnsmiljøet
I WP1 vil fluorescensprofilen til lakselus l. salmonis og torskelus C. elongatus bli beskrevet ontogenetisk (gjennom utviklingen fra larve til voksen) og for preserverte prøver. Samtidig vil fluorescensprofilen til miljøprøver av plankton bli analysert for å verifisere spesifisiteten av signalene. Dette vil munne ut i en prosedyrebeskrivelse som utarbeides med tanke på senere automatisering.
WP1: Kartlegging av fluorescens i lakselus og bakgrunnsmiljøet
I WP1 vil fluorescensprofilen til lakselus l. salmonis og torskelus C. elongatus bli beskrevet ontogenetisk (gjennom utviklingen fra larve til voksen) og for preserverte prøver. Samtidig vil fluorescensprofilen til miljøprøver av plankton bli analysert for å verifisere spesifisiteten av signalene. Dette vil munne ut i en prosedyrebeskrivelse som utarbeides med tanke på senere automatisering.
En beskrivelse av metoden per mai 2020 finnes på HI sine nettsider: Ny metode gjør lakseluslarver selvlysende.
WP2: Verifisering og sammenligning
Prosedyrebeskrivelsen fra WP1 vil bli benyttet for verifisering og sammenligning av resultater fra Norge, Skotland og Færøyene.
WP3: Rammeverk for praktisk bruk og prototypeutvikling
Resultatene fra WP1 og WP2 vil bli overført til praktisk design av en automatisert larvedeteksjonsprototype.
WP2: Verifisering og sammenligning
Prosedyrebeskrivelsen fra WP1 vil bli benyttet for verifisering og sammenligning av resultater fra Norge, Skotland og Færøyene.
WP3: Rammeverk for praktisk bruk og prototypeutvikling
Resultatene fra WP1 og WP2 vil bli overført til praktisk design av en automatisert larvedeteksjonsprototype.
Resultatene vil formidles gjennom 2 vitenskapelige artikler og 2 populærvitenskapelige artikler fra WP1 og WP2.
-
Final report: FLUOROLICE
Institute of Marine Research (IMR). Report no. 2021-30. By Rasmus Skern (IMR), Cameron Thompson (IMR), Sussie Dalvin (IMR), Anders Thorsen (IMR), Samantha Bui (IMR), Gunnvør á Norði (Fiskaaling), James E. Bron (University of Stirling), and Mark Fordyce (Marine Scotland Science/ Aberdeen Marine Laboratory).