Prosjektnummer
901760
DNA-vaksine rettet mot lakselusspytt (SaliVax)
Ny kunnskap i arbeidet mot en lakselusvaksine
• Konstrukt som hadde sekvenser som koder for peptider som skal gi sekresjon av antigenet etter produksjon i muskelcellene så ut til å gi flere individ med økte antistoffresponser.
• En metode for elektroporering av injeksjonsstedet i lakseparr har blitt utviklet.
• Fire spyttkjertelproteiner er funnet å være gode vaksinekandidater.
• Disse kan formuleres i en polyvalent vaksine uten uttalte bivirkninger der tre er fusjonert til adjuvans.
• Spesifikke mukosale antistoffer ble detektert etter DNA-vaksinering, og vaksineteknologien kan optimaliseres for bruk mot mukosale patogener.
• En metode for elektroporering av injeksjonsstedet i lakseparr har blitt utviklet.
• Fire spyttkjertelproteiner er funnet å være gode vaksinekandidater.
• Disse kan formuleres i en polyvalent vaksine uten uttalte bivirkninger der tre er fusjonert til adjuvans.
• Spesifikke mukosale antistoffer ble detektert etter DNA-vaksinering, og vaksineteknologien kan optimaliseres for bruk mot mukosale patogener.
Sammendrag av resultater fra prosjektets faglige sluttrapport (English summary further below)
En effektiv lusevaksine vil kunne begrense bruken av ikke-medikamentelle og biologiske behandlingsmetoder mot lakselus, og kan slik være en viktig driver for å redusere stress og dødelighet hos oppdrettslaks. For å øke innovasjonen innen utviklingen av lakselusvaksiner, hadde dette prosjektet som mål å analysere om lakselusens immunmodulerende proteiner kunne være aktuelle vaksinekandidater. Men da en lakselusvaksine rettet mot spyttkjertelproteiner basert på rekombinante proteiner vil være både tidkrevende, dyr og vanskelig å produsere, ønsket man å se om det var mulig å anvende DNA-vaksineteknologien i dette arbeidet. Men da DNA-vaksiner tradisjonelt sett ikke er forbundet med å indusere høye nivåer av antistoffer verken i serum eller slim, har prosjektet også sett mere generelt på muligheten for å øke mukosale nivåer av antistoffer ved bruk av DNA-vaksiner, der man kan nyttiggjøre seg av forskjellige plasmiddesign, molekylære adjuvanser og administrasjonsmetoder for å oppnå dette.
To spesifikke endringer ble testet for deres evne til å indusere en bedre antistoffrespons, kodonoptimalisering for økt uttrykk av antigenene i lakseceller, samt sekresjon av antigenene der både lakselusens eget signalpeptid og et signalpeptid fra et lakseprotein ble testet. Man testet også fire ulike kjemokiner som molekylære adjuvanser, CCL4, 19, 20 og 21, da disse er kjent for å gi en øke tilstrømming av immunceller involvert i antistoffresponser. Hvor og hvordan en DNA-vaksine blir administrert kan også påvirke dens evne til å gi en adekvat immunrespons, og både elektroporering av stikkstedet samt injeksjon med en nålløse injektor Tropis® ID Jet-injektor fra PharmaJet ble testet. Både varigheten av antigenets genuttrykk samt antistoffresponsen i serum og slim ble målt, før en videre testing av hele 7 antigen ble gjort med optimalisert vaksinedesign. Man visste også fra tidligere studier at flere spyttkjertelproteiner sannsynligvis måtte kombineres i en vaksine, og både 2-, 3-, 4- og 5-valente vaksiner ble testet over to forsøk for deres evne til å indusere gode antistoffresponser med lite bivirkninger.
Mens både kodonoptimalisering, sekresjon av antigenet samt elektroporering av stikkstedet så ut til å kunne gi økte antistoffresponser, ble de testede kjemokinene samt Jet-injektoren ikke tatt med for videre bruk. Da kjemokinene ikke viste til gode resultater, ble en molekylær adjuvans identifisert i et annet prosjekt, SaliFilaVax, inkludert (jf. “DNA-vaksine rettet mot spytt- og frontalfilamentproteiner (SaliFilaVax)” (FHF-901868)). Til tross for dette måtte et høyere antall konstrukter enn forventet analyseres, der flere ulike design og mutasjoner ble testet for en rekke antigen. Adekvate antistoffresponser ble til slutt bekreftet mot fire av de syv testede antigenene. En kombinasjon av flere spyttkjertelproteiner ble dessuten funnet å kunne injiseres uten uttalte bivirkninger, da kun tre av disse var koblet til adjuvansen. Spesielt polyvalente vaksiner som inkluderte et spesifikt antigen-adjuvans konstrukt så ut til å forbedre antistoffresponsen og en bedre respons ble sett ved injeksjon av disse sammenlignet med monovalente vaksiner. Antistoffer ble dessuten også detektert i laksens slim etter vaksinering, og viser dermed at DNA-vaksinen kan gi sekresjon av spesifikke mukosale antistoffer.
Resultatene kan dermed anvendes i videre vaksineutvikling, da prosjektet har etablert flere optimaliseringer som vil være fordelaktig å implementere og utviklet en polyvalente test-vaksiner som inkluderer hele 5 spyttkjertelproteiner. Effekten av denne polyvalente test-vaksinen har ikke blitt analysert i smitteforsøk, noe som vil bli tatt videre i SaliFilaVax-prosjektet. Da vaksinering ansees som en av de mest bærekraftige bekjempelsesmetodene mot sykdom, har prosjektets resultater dermed et stort potensial til å påvirke dagens laksenæring positivt.
Results achieved
Summary of results from the project’s final reporting
An effective lice vaccine could limit the use of non-medical and biological treatment methods against salmon lice and could thus reduce stress and mortality in farmed fish. To increase innovations in salmon lice vaccine development, this project aimed to analyze whether the salmon louse immunomodulatory proteins could be relevant vaccine candidates. However, since a salmon louse vaccine targeting immunomodulatory proteins based on recombinant proteins would be both time-consuming, expensive and difficult to produce, the project group wanted to test if it was possible to develop a salmon louse vaccine applying DNA vaccine technology. However, since DNA vaccines traditionally are not found to induce high levels of antibodies either systemically or at mucosal surfaces, the project did also test optimizations as different plasmid designs, molecular adjuvants and administration methods to enhance this.
Summary of results from the project’s final reporting
An effective lice vaccine could limit the use of non-medical and biological treatment methods against salmon lice and could thus reduce stress and mortality in farmed fish. To increase innovations in salmon lice vaccine development, this project aimed to analyze whether the salmon louse immunomodulatory proteins could be relevant vaccine candidates. However, since a salmon louse vaccine targeting immunomodulatory proteins based on recombinant proteins would be both time-consuming, expensive and difficult to produce, the project group wanted to test if it was possible to develop a salmon louse vaccine applying DNA vaccine technology. However, since DNA vaccines traditionally are not found to induce high levels of antibodies either systemically or at mucosal surfaces, the project did also test optimizations as different plasmid designs, molecular adjuvants and administration methods to enhance this.
Two specific changes were tested for their ability to induce a better antibody response, codon optimization for increased expression of the antigens in salmon cells, and secretion of the antigens where both signal peptides from the lice antigen and a salmon protein were tested. The project group also tested four different chemokines as molecular adjuvants, CCL4, 19, 20 and 21, as these are known to increase the influx of immune cell types important for antibody responses. Where and how a DNA vaccine is administered can also affect its ability to provide an adequate immune response, and both electroporation of the injection site and injection with a needle-free Tropis® ID Jet injector from PharmaJet were tested. Both the duration of the antigen's gene expression and the antibody response in serum and mucus were measured, before further testing of additional antigens was done with the optimized vaccine design. The project group also knew from previous studies that multiple immunemodulatory proteins would likely need to be combined in a vaccine, and both 2-, 3-, 4- and 5-valent vaccines were tested over two trials for their ability to induce good antibody responses with minimal side effects.
While both codon optimization, secretion of the antigen and electroporation of the injection site appeared to enhance antibody responses, the tested chemokines and the Jet injector were not found to be optimal for further use. Instead, a molecular adjuvant identified in another project, SaliFilaVax, was implemented (see “DNA-vaksine rettet mot spytt- og frontalfilamentproteiner (SaliFilaVax)” (FHF-901868). Despite this, more constructs than expected had to be analyzed, where several different designs and mutations were tested for a number of antigens. Adequate antibody responses were finally confirmed against four of the seven antigens tested. Furthermore, a combination of several salivary gland proteins could be injected without pronounced side effects, as only three of these were linked to the adjuvant. Particularly polyvalent vaccines that included a specific antigen-adjuvant construct appeared to have improved antibody responses. Antibodies were also detected in the salmon's mucus after vaccination, thus showing that the DNA vaccine can induce secretion of specific mucosal antibodies.
The project has established several optimizations that will be beneficial to implement in further vaccine development and has succeeded at formulating a polyvalent test vaccine that includes constructs encoding as many as 5 immunomodulatory proteins. The effect of this polyvalent test vaccine has not been evaluated in infection trials, which will be done in the SaliFilaVax project. As vaccination is considered one of the most sustainable methods of combating disease, the project's results therefore have great potential to positively impact today's salmon farming.
Interessante funn som avdekker at det er mange interaksjoner mellom lakselus og laksen, og at en del av disse, som tidligere ikke er utforsket, kan være en utradisjonell vei frem mot en lakselusvaksine. Den vil neppe ha 100 % effekt, men kan være et godt bidrag for lusekontroll. Det er også nyttig at vaksinetildelingsmetoden med elektroporering av skinnet viser seg gjennomførbar på laks, og kan bli en mer effektiv metode særlig for tildeling av DNA-baserte vaksiner, og sannsynligvis andre.
Lakselus gir en rekke sykdoms- og velferdsutfordringer som følge av et intensivt lusebehandlingsregime, og er til hinder for videre vekst i næringen. Et tiltak som kan gi en betydelig forbedring i forhold til dagens velferdssituasjon er en lakselusvaksine. De mest lovende vaksinekandidatene som til nå har vært testet har basert seg på at antistoffer virker eller blir tatt opp via lusens tarm. Dette har imidlertid ikke ført fram til utviklingen av en kommersiell vaksine, da antistoffene fra laksen sannsynligvis raskt blir degradert av fordøyelsesenzymer i lusens tarm. Dette prosjektet vil dermed se om proteiner som virker i grensesnittet mellom lusen og laksen kan ha et større potensiale som vaksineantigen.
I det FHF-finansierte prosjektet “Samspill mellom lakselus og laks (ModuLus)” (FHF-901564), er det identifisert immunmodulerende og antikoagulerende proteiner i lakselusens spytt som sekreres ned på laksens hud. Da antistoffer mot disse spyttkjertelproteinene ikke trenger å møte lusens fordøyelsessystem for å ha en inhiberende effekt, har disse et stort potensial som vaksinekandidater. Men ved å bruke immundempende proteiner i en vaksine, risikerer man at disse ved injeksjon kan gi en immunsupprimert laks. Prosjektet vil dermed forsøke å utvikle en DNA-vaksine, da dette gir mulighet for å enkelt endre de immunmodulerende proteinene slik at de ikke lenger vil være immundempende, for slik å kunne lage en tryggere vaksine.
I det FHF-finansierte prosjektet “Samspill mellom lakselus og laks (ModuLus)” (FHF-901564), er det identifisert immunmodulerende og antikoagulerende proteiner i lakselusens spytt som sekreres ned på laksens hud. Da antistoffer mot disse spyttkjertelproteinene ikke trenger å møte lusens fordøyelsessystem for å ha en inhiberende effekt, har disse et stort potensial som vaksinekandidater. Men ved å bruke immundempende proteiner i en vaksine, risikerer man at disse ved injeksjon kan gi en immunsupprimert laks. Prosjektet vil dermed forsøke å utvikle en DNA-vaksine, da dette gir mulighet for å enkelt endre de immunmodulerende proteinene slik at de ikke lenger vil være immundempende, for slik å kunne lage en tryggere vaksine.
• Å undersøke om man kan utnytte proteiner som er viktig i samspillet mellom lakselus og laks (parasitt-vert-interaksjonen) inn i en lakselusvaksine, ved å forsøke å avklare om laks har en iboende resistensmekanisme som er dempet av bestanddeler i lakselusens sekreter, og om det lar seg gjøre å inhibere denne slik at laksen selv aktiverer nødvendige immunresponser mot lakselusen.
• Å se mer generelt på mulighetene for å øke mukosale nivåer av antistoffer ved bruk av DNA-vaksiner, der man kan nyttiggjøre seg av forskjellige plasmiddesign, molekylære adjuvanser og administrasjonsmetoder for å oppnå dette.
• Å se mer generelt på mulighetene for å øke mukosale nivåer av antistoffer ved bruk av DNA-vaksiner, der man kan nyttiggjøre seg av forskjellige plasmiddesign, molekylære adjuvanser og administrasjonsmetoder for å oppnå dette.
Prosjektet vil gi økt kunnskap om samspillet mellom laks og lakselus (vert-parasitt-interaksjonen), og svare på om denne kunnskapen kan bli brukt inn i utvikling av vaksiner som en effektiv bekjempelsesmetode mot lakselus. En slik vaksine har dermed et potensiale til å bedre de store fiskehelse- og velferdsutfordringene knyttet til dagens metoder for lusebekjempelse. Men prosjektet vil ikke bare kunne frembringe nye, lovende vaksinekandidater for lakselus, men også ny vaksineteknologi som kan anvendes mot andre hudsykdommer i tillegg til lakselus. Prosjektet har derfor et stort potensial til å påvirke dagens laksenæring positivt, som i sum tapte anslagsvis over 5,5 milliarder kr i 2020 på grunn av lakselus.
Aktiviteten i prosjektet er inndelt i tre arbeidspakker (AP-er) med underliggende delmål (DM-er), som hver danner grunnlag for neste basert på oppnåelse av milepæler (MP-er) fra hver arbeidspakke. Disse arbeidspakkene vil i sum forsøke å utarbeide en testvaksine mot lakselus som kan gi grunnlag for en fremtidig kommersiell DNA-basert lusevaksine rettet mot lakselusens spyttkjertelproteiner.
AP1: Optimalisering av DNA-vaksiner for beskyttelse mot mukosale patogener i laks
Lakselusen er, akkurat som dens vert, et komplekst dyr, noe som kompliserer utviklingen av en vaksine. Å lykkes med en lakselusvaksine vil derfor kreve en høy presisjon og styrke på vaksineresponsen, og det vil derfor være viktig å justere inn viktige parametere rundt den valgte vaksineteknologien før en faktisk lusevaksine blir testet. Denne arbeidspakken er derfor delt inn i tre delmål:
DM1.1: Vektoroptimalisering.
DM1.2: Uttesting av forskjellige molekylære adjuvanser.
DM1.3: Utprøving av administreringsruter og metoder, for å øke sjansen for å kunne utvikle en fungerende DNA-basert lakselusvaksine.
MP1: Bestemmelse av egnet konstrukt, molekylær adjuvans og administrasjonsmetode som skal brukes i videre uttesting av lakselusvaksinen.
AP2: Spyttkjertelproteiner som DNA-vaksinekandidater
Denne arbeidspakken vil se nærmere på utvalgte spyttkjertelproteiner som i tidligere arbeid er funnet egnet som vaksineantigen. Muterte gensekvenser for disse vaksinekandidatene vil bli designet i DM2.1:
DM2.1: Design av ikke-funksjonelle spyttkjertelantigen, da proteinene må endres slik at de ser like ut for immunsystemet, men uten å være funksjonelle. Både plasmider med muterte proteiner og villtypeproteiner vil bli injisert i laks, og endringer i induksjon av spesifikke antistoffer vil bli analysert. En vet også fra tidligere studier at flere spyttkjertelproteiner må kombineres i en vaksine, dette vil bli gjort i DM2.2:
DM2.2: Uttesting av antigenkombinasjoner, doser og analyse av bivirkninger, hvor det vil analyseres hvilke kombinasjoner av antigen man kan inkludere samtidig i en DNA-vaksine og i hvor stor konsentrasjon, uten at dette går på bekostning av antistoffproduksjonen og uten uttalte bivirkninger.
DM2.3: Immunstatus i vaksinert fisk. Her vil vaksinens immunsupprimerende potensial bli testet for å sikre at alle mutasjoner gir uttrykk av ikke-funksjonelle antigen ved bruk av salmonid alfavirus (SAV) som smittemodell. Det vil også her følges med på eventuelle andre bivirkninger.
AP3: Vaksineforsøk
I denne arbeidspakken vil det testes om vaksinekonstruktet som er utarbeidet i AP1 og AP2 kan indusere en beskyttende respons i laksen mot lakselus. Hvis vaksinert fisk har lavere smitte, vil dette danne grunnlaget for en videreutvikling av konseptet.
DM3.1: Utføre et første smitteforsøk med lakselus etter vaksinering, for å undersøke om det er mulig å redusere eller hindre etablering av lakseluskopepoditter på vaksinert fisk.
DM3.2: Analyse av vaksinens varighet og om det er behov for boosterdoser ved å gjenta smitteforsøket 2, 6 og 12 måneder etter vaksinering. Boosterdoser vil bli gitt hvis en eventuell beskyttelse er synkende ved 2 eller 6 måneder.
MP3: Vurdering av spyttkjertelproteinenes potensiale som vaksineantigen i en DNA-vaksine mot lakselus.
AP1: Optimalisering av DNA-vaksiner for beskyttelse mot mukosale patogener i laks
Lakselusen er, akkurat som dens vert, et komplekst dyr, noe som kompliserer utviklingen av en vaksine. Å lykkes med en lakselusvaksine vil derfor kreve en høy presisjon og styrke på vaksineresponsen, og det vil derfor være viktig å justere inn viktige parametere rundt den valgte vaksineteknologien før en faktisk lusevaksine blir testet. Denne arbeidspakken er derfor delt inn i tre delmål:
DM1.1: Vektoroptimalisering.
DM1.2: Uttesting av forskjellige molekylære adjuvanser.
DM1.3: Utprøving av administreringsruter og metoder, for å øke sjansen for å kunne utvikle en fungerende DNA-basert lakselusvaksine.
MP1: Bestemmelse av egnet konstrukt, molekylær adjuvans og administrasjonsmetode som skal brukes i videre uttesting av lakselusvaksinen.
AP2: Spyttkjertelproteiner som DNA-vaksinekandidater
Denne arbeidspakken vil se nærmere på utvalgte spyttkjertelproteiner som i tidligere arbeid er funnet egnet som vaksineantigen. Muterte gensekvenser for disse vaksinekandidatene vil bli designet i DM2.1:
DM2.1: Design av ikke-funksjonelle spyttkjertelantigen, da proteinene må endres slik at de ser like ut for immunsystemet, men uten å være funksjonelle. Både plasmider med muterte proteiner og villtypeproteiner vil bli injisert i laks, og endringer i induksjon av spesifikke antistoffer vil bli analysert. En vet også fra tidligere studier at flere spyttkjertelproteiner må kombineres i en vaksine, dette vil bli gjort i DM2.2:
DM2.2: Uttesting av antigenkombinasjoner, doser og analyse av bivirkninger, hvor det vil analyseres hvilke kombinasjoner av antigen man kan inkludere samtidig i en DNA-vaksine og i hvor stor konsentrasjon, uten at dette går på bekostning av antistoffproduksjonen og uten uttalte bivirkninger.
DM2.3: Immunstatus i vaksinert fisk. Her vil vaksinens immunsupprimerende potensial bli testet for å sikre at alle mutasjoner gir uttrykk av ikke-funksjonelle antigen ved bruk av salmonid alfavirus (SAV) som smittemodell. Det vil også her følges med på eventuelle andre bivirkninger.
MP2: Bestemmelse av egnet antigenkombinasjon for en trygg lakselusvaksine som induserer adekvate antistoffkonsentrasjoner.
AP3: Vaksineforsøk
I denne arbeidspakken vil det testes om vaksinekonstruktet som er utarbeidet i AP1 og AP2 kan indusere en beskyttende respons i laksen mot lakselus. Hvis vaksinert fisk har lavere smitte, vil dette danne grunnlaget for en videreutvikling av konseptet.
DM3.1: Utføre et første smitteforsøk med lakselus etter vaksinering, for å undersøke om det er mulig å redusere eller hindre etablering av lakseluskopepoditter på vaksinert fisk.
DM3.2: Analyse av vaksinens varighet og om det er behov for boosterdoser ved å gjenta smitteforsøket 2, 6 og 12 måneder etter vaksinering. Boosterdoser vil bli gitt hvis en eventuell beskyttelse er synkende ved 2 eller 6 måneder.
MP3: Vurdering av spyttkjertelproteinenes potensiale som vaksineantigen i en DNA-vaksine mot lakselus.
Følgende formidling er planlagt:
Faglige presentasjoner
Resultater vil bli formidlet på nasjonale og internasjonale fiskehelsekonferanser og møter med industriell deltagelse.
Populærformidling
Resultater med spesiell næringsnytte vil bli publisert i populærvitenskapelige artikler i bransjetidsskrifter for å gjøre disse tilgjengelig for oppdrettere og fiskevaksineindustrien.
Vitenskapelige artikler
Generell kunnskap om lakselusens vert-parasitt-interaksjon samt mukosal immunologi og vaksineutvikling vil bli publisert som vitenskapelige artikler i internasjonale tidsskrifter. Alle artikler bli publisert i tidsskrift med åpen tilgang (open access).
Industrielt samarbeid
Hvis prosjektet lykkes i å identifisere en potensiell lakselusvaksine vil dette bli formidlet videre til selskap som jobber med fiskevaksiner for et videre samarbeid mot et kommersielt produkt
Faglige presentasjoner
Resultater vil bli formidlet på nasjonale og internasjonale fiskehelsekonferanser og møter med industriell deltagelse.
Populærformidling
Resultater med spesiell næringsnytte vil bli publisert i populærvitenskapelige artikler i bransjetidsskrifter for å gjøre disse tilgjengelig for oppdrettere og fiskevaksineindustrien.
Vitenskapelige artikler
Generell kunnskap om lakselusens vert-parasitt-interaksjon samt mukosal immunologi og vaksineutvikling vil bli publisert som vitenskapelige artikler i internasjonale tidsskrifter. Alle artikler bli publisert i tidsskrift med åpen tilgang (open access).
Industrielt samarbeid
Hvis prosjektet lykkes i å identifisere en potensiell lakselusvaksine vil dette bli formidlet videre til selskap som jobber med fiskevaksiner for et videre samarbeid mot et kommersielt produkt