Prosjektnummer
901510
Vaksine mot lakselus: Fremstilling og test av nye vaksinekandidater i småskalaforsøk
Test av proteiners mulige effekt som bidrag til arbeidet med vaksiner mot lus
• Der var store variasjoner i antall lus per fisk i alle grupper, som gjør det vanskelig å finne signifikante forskjeller. Til å se mindre effekter av testvaksinen i form av reduksjon i lusepåslag trengtes det under disse omstendigheter et større antall fisk per gruppe.
• Ingen av testvaksine viste en relevant innvirkning på lusens utvikling, blodopptak eller reproduksjon.
• Testvaksinene viste ingen redusert vekst av fisken eller relevante bivirkninger i form av sammenvoksinger mellom fiskens bukvegg og organer.
• Ingen av testvaksine viste en relevant innvirkning på lusens utvikling, blodopptak eller reproduksjon.
• Testvaksinene viste ingen redusert vekst av fisken eller relevante bivirkninger i form av sammenvoksinger mellom fiskens bukvegg og organer.
Sammendrag fra prosjektets faglige sluttrapport
En virksom vaksine mot lakselus ville være et forebyggende tiltak som kunne begrense behandlingen mot lus i merden. Ved vaksinering simulerer man kontakt med patogener, her med lakselusen, ved å injisere et spesifikk lakselusprotein i laksen som utløser antistoffdannelse mot dette proteinet, som skal trigge fiskens adaptive immunforsvar. En virksom vaksine må gi beskyttelse mot lakselus enten i form av reduksjon av lusepåslag eller i form av reduksjon av overlevelse eller reproduksjonsraten.
Til dette formålet ble rekombinante proteiner av åtte utvalgte kandidatgener produsert. Basert på tidligere akkumulert kunnskap (tidsmessig og lokale gen-uttrykningsmønstre og gen-knock-down-eksperimenter) ble forskjellige proteiner valgt, som er uttrykt i lusens tarm og danner dermed en kontaktflate med laksens blod.
Det er også av betydning at genene er uttrykt i de parasittiske stadiene. Relevansen av disse proteiner var bekreftet med tidligere gjennomførte gen-knock-down-eksperimenter, som førte til redusert overlevelse eller reproduksjon. Syv forskjellige proteiner ble rekombinant uttrykt. To ferritiner (testvaksine 1), en scavenger receptor (testvaksine 2), en chitin synthase (testvaksine 4), et protein som ligner en V-type proton ATPase subunit (testvaksine 5), og 3 forskjellige proteiner, som ligner Sodium/potassium-transporting ATPase subunits (testvaksine 6–8).
I tillegg ble en blanding av isolerte lakselusproteiner brukt (testvaksine 3). Tilsatt adjuvant ble disse testvaksinene injisert i fisken og effekten mot lakselus ble testet i smitteforsøk. Påslag, utvikling og reproduksjonssukksess av lakselusen ble dokumentert og fiskens immunforsvar og eventuelle bivirkninger ble undersøkt. Det var stor variasjon i lusepåslag mellom fisk fra alle grupper.
Ingen av testvaksinene viste en signifikant beskyttende effekt. Innvirkning på lusens utvikling ble ikke funnet. Ingen av testvaksinene førte til hemning av vekst eller bivirkninger i fisken. Styrken av fiskens immunforsvar varierte mellom testvaksiner.
En virksom vaksine mot lakselus ville være et forebyggende tiltak som kunne begrense behandlingen mot lus i merden. Ved vaksinering simulerer man kontakt med patogener, her med lakselusen, ved å injisere et spesifikk lakselusprotein i laksen som utløser antistoffdannelse mot dette proteinet, som skal trigge fiskens adaptive immunforsvar. En virksom vaksine må gi beskyttelse mot lakselus enten i form av reduksjon av lusepåslag eller i form av reduksjon av overlevelse eller reproduksjonsraten.
Til dette formålet ble rekombinante proteiner av åtte utvalgte kandidatgener produsert. Basert på tidligere akkumulert kunnskap (tidsmessig og lokale gen-uttrykningsmønstre og gen-knock-down-eksperimenter) ble forskjellige proteiner valgt, som er uttrykt i lusens tarm og danner dermed en kontaktflate med laksens blod.
Det er også av betydning at genene er uttrykt i de parasittiske stadiene. Relevansen av disse proteiner var bekreftet med tidligere gjennomførte gen-knock-down-eksperimenter, som førte til redusert overlevelse eller reproduksjon. Syv forskjellige proteiner ble rekombinant uttrykt. To ferritiner (testvaksine 1), en scavenger receptor (testvaksine 2), en chitin synthase (testvaksine 4), et protein som ligner en V-type proton ATPase subunit (testvaksine 5), og 3 forskjellige proteiner, som ligner Sodium/potassium-transporting ATPase subunits (testvaksine 6–8).
I tillegg ble en blanding av isolerte lakselusproteiner brukt (testvaksine 3). Tilsatt adjuvant ble disse testvaksinene injisert i fisken og effekten mot lakselus ble testet i smitteforsøk. Påslag, utvikling og reproduksjonssukksess av lakselusen ble dokumentert og fiskens immunforsvar og eventuelle bivirkninger ble undersøkt. Det var stor variasjon i lusepåslag mellom fisk fra alle grupper.
Ingen av testvaksinene viste en signifikant beskyttende effekt. Innvirkning på lusens utvikling ble ikke funnet. Ingen av testvaksinene førte til hemning av vekst eller bivirkninger i fisken. Styrken av fiskens immunforsvar varierte mellom testvaksiner.
Selv om forsøkene ikke synes å ha gitt indikasjoner på at noen av de testede proteinene bidro til redusert påslag eller dårligere utvikling av lakselus, har prosjektet bidratt med kunnskap som er nyttig i videre arbeid med å finne frem til mulige vaksiner mot lakselus. Negative resultater i form av “ingen statistisk effekt” er nyttig som grunnlag for nye forsøk der andre proteiner og mekanismer studeres.
-
Popular presentation: In search for a new vaccine against the salmon louse (Lepeophtheirus salmonis)
University of Berge (UiB). Poster presented at the Norwegian Biochemical Society (NBS) 56th contact meeting in January 2020. By Christiane Eichner, Heidi Kongshaug, Michael Dondrup, Erna Irene Heggland, and Frank Nilsen.
-
Sluttrapport: Vaksine mot lakselus: Fremstilling og test av nye vaksinekandidater i småskala forsøk
Universitetet i Bergen. Februar 2020. Av Christiane Eichner.
Fiskevaksiner har i stor grad bidratt til å redusere bruk av medikamenter (spesielt antibiotika) mot fiskesykdommer, og har vist seg å være det mest forebyggende tiltaket i fiskeoppdrett når det gjelder bakterie og virussykdommer. Tilsvarende vil en vaksine mot lakselus kunne begrense behandlinger mot lus i merden.
Hovedformålet med vaksinering er å danne beskyttelse mot patogener ved å utløse en immunreaksjon i laksen ved kontakten med respektive patogen. Fisk har både et medfødt (innate) og ervervet (adaptivt) immunforsvar. Det medfødte virker raskt og er relativt uspesifikt mens det ervervede immunforsvaret tar lengre tid for å reagere ved første kontakt med patogenet, men er veldig spesifikt og effektivt. Det er det adaptive immunforsvaret til fisken som stimuleres ved vaksinering.
Ved vaksinering simulerer man kontakt med et patogen, i dette tilfellet lakselus, ved å injisere et spesifikt lakselusprotein i laksen som utløser antistoffdannelse mot dette proteinet. Det er avgjørende å finne proteinet som utløser denne reaksjonen og som i tillegg fører til redusert overlevelse/fitness av lakselus etter vaksinering.
Ved Sea Lice Research Center (SLRC) har undersøkelse av lakselusens biologi på molekylært nivå vært et sentralt tema, og undersøkelse av forskjellige proteiner som kan være mål som vaksinekandidater er beskrevet. Lakselusens komplette genom er sekvensert i prosjektet “The Salmon Louse Genome Sequencing Project: Part 1” (FHF-900400), og undersøkelse av genuttrykket i alle stadier og forskjellige vev danner grunnlag for valg av nye vaksinekandidater. To storskala vaksineforsøk har blitt utført i de siste to årene. Dette prosjektet ville være en fortsettelse av denne tilnærmingen.
Hovedformålet med vaksinering er å danne beskyttelse mot patogener ved å utløse en immunreaksjon i laksen ved kontakten med respektive patogen. Fisk har både et medfødt (innate) og ervervet (adaptivt) immunforsvar. Det medfødte virker raskt og er relativt uspesifikt mens det ervervede immunforsvaret tar lengre tid for å reagere ved første kontakt med patogenet, men er veldig spesifikt og effektivt. Det er det adaptive immunforsvaret til fisken som stimuleres ved vaksinering.
Ved vaksinering simulerer man kontakt med et patogen, i dette tilfellet lakselus, ved å injisere et spesifikt lakselusprotein i laksen som utløser antistoffdannelse mot dette proteinet. Det er avgjørende å finne proteinet som utløser denne reaksjonen og som i tillegg fører til redusert overlevelse/fitness av lakselus etter vaksinering.
Ved Sea Lice Research Center (SLRC) har undersøkelse av lakselusens biologi på molekylært nivå vært et sentralt tema, og undersøkelse av forskjellige proteiner som kan være mål som vaksinekandidater er beskrevet. Lakselusens komplette genom er sekvensert i prosjektet “The Salmon Louse Genome Sequencing Project: Part 1” (FHF-900400), og undersøkelse av genuttrykket i alle stadier og forskjellige vev danner grunnlag for valg av nye vaksinekandidater. To storskala vaksineforsøk har blitt utført i de siste to årene. Dette prosjektet ville være en fortsettelse av denne tilnærmingen.
Å identifisere et eller flere protein som injisert i laksen som vaksine, gir beskyttelse mot lakselus. Dette kan være enten i form av reduksjon av lusepåslag eller i form av reduksjon av overlevelse eller reproduksjonsrate.
Delmål
1. Å lage rekombinant protein av utvalgte kandidatgener ved å klone kandidatgenene inn i en ekspresjonsvektor og uttrykke genet i en cellekultur. For de gener som er vanskelige å uttrykke vil man lage syntetiske peptider og bruke de i en vaksine.
2. Å foreta kontrollert smitteforsøk med fisk vaksinert med de ulike vaksiner i tillegg til en kontrollgruppe som skal gi informasjon om effekten på lusesmitte og utvikling.
Delmål
1. Å lage rekombinant protein av utvalgte kandidatgener ved å klone kandidatgenene inn i en ekspresjonsvektor og uttrykke genet i en cellekultur. For de gener som er vanskelige å uttrykke vil man lage syntetiske peptider og bruke de i en vaksine.
2. Å foreta kontrollert smitteforsøk med fisk vaksinert med de ulike vaksiner i tillegg til en kontrollgruppe som skal gi informasjon om effekten på lusesmitte og utvikling.
Nytteverdien ved vellykket lusevaksine er veldig høy. Videre utvikling til en kommersiell vaksine vil dette gi oppdrettsnæringen et nytt verktøy til å redusere mengden med lakselus på oppdrettsfisken uten behandling i merdene. I forhold til kostnader som påløper ved behandling mot lakselus i merdene er ressursbruk av dette prosjekt ubetydelig. Hvis resultatet fører til reduksjon av avlusningsfrekvens ville dette være en gevinst for oppdrettsnæringen. Det er veldig vanskelig å finne den riktige vaksinekandidaten, men forutsetningene for å lykkes er den akkumulerte kunnskap som har vært generert de siste årene.
Prosjektet skal gjennomføres i tre delforsøk, som er tidsmessig overlappende:
Delforsøk 1
Det første delforsøket innebærer fremstilling av testvaksinene ved å uttrykke rekombinant protein i bakterieceller. Et konstrukt av hvert kandidatgen med optimaliserte kodonbruk bestilles og klones i en vektor. Det uttrykte rekombinante protein blandes med adjuvans og brukes som testvaksine. Det skal fremstilles ti forskjellige testvaksiner i to omganger. Etter fremstilling av fem testvaksiner begynner det første hovedforsøket, hvor vaksinene skal uttestes i smitteforsøk.
Delforsøk 2
Det andre hovedforsøket gjennomføres tidsforskjøvet på samme måte etter fremstilling av de neste fem testvaksinene. For dette formålet blir 18 laksesmolt per gruppe individmerket og vaksinert. Boost-vaksineringen vil gjennomføres ca. 6 uker før smoltifisering. Etter tilvenningen til saltvann fordeles gruppene i enkeltfisk-tanker, hvor lusesmitte med et definert antall lus per fisk finner sted. Per gruppe blir ni fisk smittet. Lusetap i løpet av eksperimentet blir fulgt opp for de bevegelige stadier ved å filtrere utløpsvannet, som blir kontinuerlig sjekket for lus. Samplingen skal gjennomføres når lusene i kontrollgruppen har eggstrenger. Lusetall og utvikling av lus på hver fisk dokumenteres. Eventuelle eggstrenger legges til klekking i klekkebrønner for å observere reproduksjonssuksess. Blodprøver av fisken tas for å undersøke fiskens antistoffproduksjon mot det spesifikke protein. Ved tilfeller av signifikante forskjeller mellom kontrollgruppen og en av vaksinegruppene blir eksperimentet med denne gruppen gjentatt (med de andre ni fisk, som ble vaksinert).
Delforsøk 3
I det tredje delforsøket skal fiskens antistoffdannelse undersøkes ved såkalt enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), hvor det spesifikke antistoffet i fiskeblodet fra den vaksinerte fisken kan måles ved en fargereaksjon. Klekking av egg observeres for å undersøke reproduksjonssuksessen. Foto av lus tatt ved avslutning analyseres for forandringer i utviklingen. Ved eventuelle synlige forandringer blir også den fikserte lusen histologisk analysert.
Delforsøk 1
Det første delforsøket innebærer fremstilling av testvaksinene ved å uttrykke rekombinant protein i bakterieceller. Et konstrukt av hvert kandidatgen med optimaliserte kodonbruk bestilles og klones i en vektor. Det uttrykte rekombinante protein blandes med adjuvans og brukes som testvaksine. Det skal fremstilles ti forskjellige testvaksiner i to omganger. Etter fremstilling av fem testvaksiner begynner det første hovedforsøket, hvor vaksinene skal uttestes i smitteforsøk.
Delforsøk 2
Det andre hovedforsøket gjennomføres tidsforskjøvet på samme måte etter fremstilling av de neste fem testvaksinene. For dette formålet blir 18 laksesmolt per gruppe individmerket og vaksinert. Boost-vaksineringen vil gjennomføres ca. 6 uker før smoltifisering. Etter tilvenningen til saltvann fordeles gruppene i enkeltfisk-tanker, hvor lusesmitte med et definert antall lus per fisk finner sted. Per gruppe blir ni fisk smittet. Lusetap i løpet av eksperimentet blir fulgt opp for de bevegelige stadier ved å filtrere utløpsvannet, som blir kontinuerlig sjekket for lus. Samplingen skal gjennomføres når lusene i kontrollgruppen har eggstrenger. Lusetall og utvikling av lus på hver fisk dokumenteres. Eventuelle eggstrenger legges til klekking i klekkebrønner for å observere reproduksjonssuksess. Blodprøver av fisken tas for å undersøke fiskens antistoffproduksjon mot det spesifikke protein. Ved tilfeller av signifikante forskjeller mellom kontrollgruppen og en av vaksinegruppene blir eksperimentet med denne gruppen gjentatt (med de andre ni fisk, som ble vaksinert).
Delforsøk 3
I det tredje delforsøket skal fiskens antistoffdannelse undersøkes ved såkalt enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), hvor det spesifikke antistoffet i fiskeblodet fra den vaksinerte fisken kan måles ved en fargereaksjon. Klekking av egg observeres for å undersøke reproduksjonssuksessen. Foto av lus tatt ved avslutning analyseres for forandringer i utviklingen. Ved eventuelle synlige forandringer blir også den fikserte lusen histologisk analysert.
Resultatene skal presenteres på relevante FHF-samlinger og SLRC sitt åpne seminar om lakselus. En populærvitenskapelig artikkel skal publiseres på nettsidene til SLRC og på Lusedata.no.
Publisering av en vitenskapelig artikkel i et internasjonalt tidsskrift er planlagt.
Publisering av en vitenskapelig artikkel i et internasjonalt tidsskrift er planlagt.
-
Sluttrapport: Vaksine mot lakselus: Fremstilling og test av nye vaksinekandidater i småskala forsøk
Universitetet i Bergen. Februar 2020. Av Christiane Eichner.