Til innholdet

Prosjektnummer

901462

Prosjektinformasjon

Prosjektnummer: 901462
Status: Avsluttet
Startdato: 01.08.2018
Sluttdato: 01.02.2022

Etablering av multiplex immun-assays for måling av biomarkører for helse og velferd hos atlantisk laks (Salm-Plex)

​Nye verktøy for overvåking av helse og velferd hos laks
​• Nye og relevante biomarkører for inflammasjon (betennelse) hos atlantisk laks ble identifisert ved plasma proteomikk. Disse inkluderer cathelicidin-2, L-plastin og sTLR5.
• L-plastin i kompleks i blodet kan komme fra infiltrerende immunceller i hjerte hos individer med alvorlig CMS-relatert hjerteinflammasjon.
• L-plastin er en lovende biomarkør for CMS-relatert dødelighet hos laks.
• Et kule-basert multiplex immunassay kan anvendes for samtidig måling av stoffskiftehormonene T3, T4 og stresshormonet kortisol i blod hos laks.
Sammendrag av resultater fra prosjektets faglige sluttrapport (Summary in English further below)
De største utfordringene i oppdrettsnæringen er knyttet til infeksjonssykdommer og fiskevelferd, og det er et stort behov for utvikling av verktøy som kan dokumentere laksens helsetilstand. Akuttfaseproteiner og andre biomarkører for inflammasjon (betennelse) er viktige diagnostiske indikatorer for tidlig sykdomspåvisning i human- og veterinærmedisin. Hos fisk er disse mindre studert og det mangler verktøy for å måle forekomsten av biologiske parametere i blodet.

Målsettingen med dette prosjektet har vært å identifisere akuttfaseproteiner og biomarkører for inflammasjon, sykdom og stress i blod fra fisk og etablere ny teknologi for måling av disse. For å identifisere relevante biomarkører for inflammasjon, ble det utført plasma proteomikk på materiale fra en tidsstudie av fisk smittet med en akutt bakteriell infeksjon og på usmittet kontrollfisk. I tillegg til proteiner som var differensielt utrykt mellom smittet fisk og kontroller, ble det funnet unikt utrykte plasmaproteiner hos smittet fisk, inkludert nye og lovende blod-biomarkører for inflammasjon; cathelicidiner, L-plastin og løselig toll-like receptor (TLR)5. Resultatene fra dette studiet har tilført verdifull informasjon om laksens plasma proteom.

Utviklingen av verktøy for overvåkning av oppdrettslaksens helse krever en tverrfaglig tilnærming, spesielt i grensesnittet mellom laksens fysiologi og immunrespons. Prosjektet opprettet derfor samarbeid med flere relevante FHF-finansierte prosjekter som ser på laksens fysiologi i sammenheng med sykdomsutvikling og robusthet. Gjennom samarbeid med prosjektet “Karakterisering, prediksjon og reduksjon av kardiomyopatisyndrom (CMS) hos atlantisk laks (SALMOCARD)” (FHF-901672) ble det undersøkt om biomarkør-kandidater identifisert ved plasma proteomikk kunne brukes i sammenheng med hjerteinflammasjon ved CMS. Resultatene viste en korrelasjon mellom dødelighet under CMS og nivåer av biomarkøren L-plastin i blod og hjerte. Dødelighet var assosiert med alvorlige lesjoner i spongiøst myokard med infiltrasjon av inflammatoriske mononukleære celler. Til sammen indikerer disse resultatene at L-plastin kan komme fra infiltrerende immunceller i hjerte hos individer med alvorlig CMS-relatert hjerteinflammasjon.

Videre arbeid vil undersøke om L-plastin kan brukes som biomarkør for prediksjon av CMS-relatert dødelighet. Stoffskiftehormonene T3 og T4 har en avgjørende rolle under initieringen av laksen smoltifisering. Gjennom et samarbeid med prosjektet “Identifisering av miljømessige signaler som regulerer smoltifisering og modning hos oppdrettslaks: Et funksjonelt grunnlag for å redusere taperfisk og tidlig kjønnsmodning” (FHF-901590) ble det validert et kule-basert multipleks immunassay for samtidig måling av stoffskiftehormonene T3 og T4 samt stresshormonet kortisol i blod fra laks. Metoden ble validert på prøver fra et kommersielt gjennomstrømningsanlegg, og resultatene viser at metoden fungerer veldig godt til måling av T3 og T4 og kortisol samtidig i serum fra laks der konvensjonell ELISA-metode har hatt for lav sensitivitet. Resultater fra denne kohorten viste en markant økning av plasma T3 fire uker etter oppstart av vintersignal, før denne faller igjen mot slutten av ferskvannsperioden. I motsetning er nivåer av T4 høyest i plasma rett før utsett i sjø. Mengden plasma T3 øker igjen markant rundt åtte uker etter utsett. På dette tidspunktet ligger T3-nivåer hos taperfisk fra samme kohort betydelig lavere. Foreløpige resultater indikerer at plasma kortisol-nivåer er høyest i parr og etter åtte uker i sjø. Det var ingen signifikante forskjeller i kortisol-nivåer mellom taperfisk og vanlige kontroller i samme kohort ved åtte uker etter utsett. Verktøy for måling av biologiske parametere som akuttfaseproteiner, biomarkører for inflammasjon, stoffskiftehormoner og stresshormonet kortisol vil kunne ha høy fremtidig bruksverdi for akvakulturnæringen. Etter videre validering vil biomarkører identifisert i prosjektet kunne brukes i fremtidig overvåking av helse og velferd hos oppdrettslaks, og kunne komplementere og understøtte andre verktøy som video-/kameraovervåkning og bidra inn i beslutningsgrunnlaget for produksjons -og smittevernmessige tiltak for oppdrettsnæringen.

Results achieved
Summary of results from the project’s final report 
The greatest challenges in Atlantic salmon aquaculture are related to infectious diseases and welfare, and there is an urgent need for development of tools for documentation of health of farmed fish. Acute-phase proteins and other inflammatory biomarkers are important early diagnostic indicators of disease in human and veterinary medicine. These are however less studied in fish, where there is a general lack of tools for measurement of biological parameters in blood. The aim of this project was to identify relevant acute-phase proteins and biomarkers of inflammation, disease and stress in blood from fish and to develop new technology for their assessment. For this purpose, a plasma proteomics approach was applied to identify biomarkers of inflammation in a time-course study of fish challenged by an acute bacterial infection and non-infected controls. In addition to proteins differentially expressed in infected fish and controls, a panel of plasma proteins were uniquely identified in infected fish. These included promising biomarkers of inflammation, such as cathelicidins, L-plastin and soluble till-like receptor (TLR)5. The results from this study provide valuable protein-level evidence for the unreviewed salmon proteome.

Development of tools for surveillance of health in farmed salmon requires an interdisciplinary approach especially at the interface between salmon physiology and immune response. The project has established collaboration with several relevant FHF funded projects focusing on salmon physiology in relation to disease development and robustness. Through collaboration with the project ‘SALMOCARD: Characterizing, predicting and mitigating cardiomyopathy syndrome (CMS) in Atlantic salmon’ (FHF-901672) the project has examined whether biomarkers of inflammation identified by plasma proteomics can be applied as biomarkers of cardiac inflammation in relation with CMS. CMS is a severe infectious cardiac disease affecting Atlantic salmon that leads to sudden death and poses serious economical  and fish welfare challenges, and currently there are no treatment or effective preventive tools available. The results showed an association between CMS-related mortality and the levels of L-plastin in blood and heart. Mortality was correlated with severe lesions on the spongious myocardium and inflammatory mononuclear cell infiltration. Together these results indicate that L-plastin may originate from immune cells infiltrating the heart of individuals with severe cardiac inflammation.

Future work will examine whether L-plastin may serve as a predictive biomarker of CMS-related mortality The thyroid hormones T3 and T4 play crucial roles in the initiation of salmonid smoltification. Through collaboration with the project ‘Identifisering av miljømessige signaler som regulerer smoltifisering og modning hos oppdrettslaks: Et funksjonelt grunnlag for å redusere taperfisk og tidlig kjønnsmodning’ (FHF-901590) the project has validated a bead-based multiplex immunoassay for simultaneous measurement of T3 and T4 and the stress hormone Cortisol. The method was validated on samples from a commercial flow-through facility, and the results show that the assay functions well for simultaneous measurement of plasma T3, T4 and cortisol, where previous ELISA have shown sensitivity. In the examined cohort, there was a marked increase of plasma T3 at 4 weeks after the onset of the winter-signal, before the T3 levels again showed a drop towards the end of the freshwater period. In contrast, plasma T4 levels were highest just prior to seawater transfer (SWT). T3 levels show a marked increase at 8 weeks post SWT. At that timepoint, T3 levels in loser fish from the same cohort were significantly lower. The results further showed a peak in plasma cortisol levels in parr and in growers after 8 weeks in sea. There were no significant differences in plasma cortisol between loser fish and normal controls at 8 weeks post SWT. Tools for measurement of biological parameters such as acute-phase proteins, biomarkers of inflammation, metabolic hormones and stress hormones will be of a high future value for the aquaculture industry. Following additional validation, biomarkers identified during the Salm-plex project can be utilized in future monitoring of health and welfare of farmed salmonids and complement and support other tools such as video -/camera surveillance and together form a basis for decisions making during production and infection control measures.

Vitenskapelig publisering/ Scientific publications
– Baojian Sun, Dino van Dissel, Ingrid Mo, Preben Boysen, Hanne Haslene-Hox, and Hege Lund, ‘Identification of novel biomarkers of inflammation in Atlantic salmon (Salmo salar L.) by a plasma proteomic approach’, Developmental & Comparative Immunology, 127 (2022), 104268. doi.org/10.1016/j.dci.2021.104268.

Flere manuskripter er under arbeid eller til vurdering og legges her når publisert.
​Prosjektet har identifisert nye biomarkører for viktige helseparametere hos oppdrettslaks som immunrespons og sykdomsmotstand mot hjertesykdommen CMS, samt ny metodikk for samtidig måling av for ekspempel hormoner i blodplasma. Disse verktøyene kan benyttes til overvåking av helse og velferd hos oppdrettslaks, og gjennom implementering bidra til å forbedre beslutningsgrunnlaget for produksjons- og smittevernmessige tiltak i oppdrettsnæringen.
Dagens største utfordringer i oppdrettsnæringen er knyttet til infeksjonssykdommer og fiskevelferd, og det er behov for utvikling av verktøy som kan dokumentere fiskens helse- og velferdsstatus.

Prosjektgruppen ønsker å etablere xMAP® multiplex-teknologi for enkel måling av akuttfaseproteiner, kortisol og serotonin i atlantisk laks. Multiplex-teknologi muliggjør påvisning av flere titalls analytter på samme tid og i samme prøvevolum, slik at også små blodprøver på levende fisk vil gi stor nytteverdi. Ved å ta i bruk metoden for akuttfaseproteiner, inflammasjonsmarkører og stresshormoner, vil sykdom, inflammasjon, vevsskade og stress kunne påvises før manifestasjon av kliniske symptomer hos fisken, og før eventuell sykdomstilstand blir et betydelig problem for oppdretter.

Immunologi-gruppen på NMBU Veterinærhøgskolen (Lund, Boysen og Storset) satser sterkt på forskning på immunrespons hos laks, blant annet gjennom deltagelse i “ImCom: Development of tools for assessment of the immune competence of Atlantic salmon smolts and growers”, ledet av Nofima og finansiert av Forskningsrådet (prosjektnr. 267644). Synergier med ImCom-prosjektet vil gi tilgang til kunnskap og relevant prøvemateriale som kan anvendes i prosjektet.
 
Øverli og Beitnes Johansen har lang erfaring med forskning på stress-fysiologi og velferd hos laksefisk. Gruppen leder i dag to prosjekter finansiert av Forskningsrådet (FRIMEDBIO 2015–2018 prosjektnr. 240116 og TOPPFORSK 2016–2020 prosjektnr. 250048) og er partnere i et HAVBRUK2-prosjekt (prosjektnr. 267788).
 
Målsetningen med prosjektet er i tråd med FHFs handlingsplan og prioriteringer innen fiskehelse og fiskevelferd.
Å etablere verktøy for måling av inflammasjon-, akuttfase- og stress-relaterte biomarkører hos atlantisk laks, for tidlig sykdomspåvisning og helseovervåkning.
 
Delmål
• Å produsere og validere spesifikke antistoffer som gjenkjenner kandidat biomarkører hos atlantisk laks.
• Å etablere multiplex immunassays for måling av biomarkører, inkludert standardisering av metoder for forbehandling av prøvemateriale og etablering av cut-off-verdier eller referanseverdier.
• Å implementere kandidat multiplex-assays for analyser av feltprøver.
Prosjektet har som mål å levere et fleksibelt verktøy for oppdrettsnæringen med stor nytteverdi for helse- og velferdsovervåkning i alle ledd av produksjonskjeden til laksefisk.

Metodene vil kunne anvendes under relativt enkle laboratorieforhold, og implementeres i rutineprogrammer. Sykdom vil kunne påvises i en tidlig fase ved ikke-letale prøveuttak, og danne beslutningsgrunnlag for produksjons- og smittevern-messige tiltak.

I og med at mange aspekter ved akuttfaseresponsen hos fisk er ukjent, vil prosjektet samtidig bidra til å genere ny kunnskap om tidlig sykdomsutvikling hos laks, noe som vil være av betydning for videre forskning innenfor dette området.

Prosjektet innehar potensielt en høy nytteverdi med lave kostnader i utviklingsfasen sammenlignet med prosjektets omfang, blant annet fordi prosjektet vil basere seg hovedsakelig på prøvemateriale fra tidligere og pågående prosjekter prosjektgruppen er involvert i.
Prosjektet er delt inn i tre arbeidspakker (AP-er):
 
AP1: Seleksjon og produksjon av reagenser
AP1 er laboratorieorientert og fokuserer på produksjon av rekombinante proteiner og antistoffer mot utvalgte kandidatmarkører for inflammasjon, akuttfase og stress hos laks.

1.1. Screening av biomarkører.
Spesialdesignet smitteforsøk (VESO Vikan), etterfulgt av analyser ved plasma proteomikk og real time (sanntids) polymerasekjedereaksjon (RT PCR).
1.2. Utprøvning av eksisterende reagenser.
1.3. Produksjon av rekombinante proteiner.
Rekombinante proteiner utrykkes i et etablert modellsystem basert på Baculovirus og insektceller.
1.4. Produksjon av antistoffer.
 
AP2: Etablering og validering av multiplex immunassays
AP2 fokuserer på etablering av multiplex immunassays for måling av biomarkører i plasma ved bruk av kommersielle antistoffer og nye antistoffer produsert i AP1.

2.1. Validering på prøvemateriale fra AP1.
2.2. Validering på tidligere innsamlet prøvemateriale og representativt feltmateriale.
 
AP3: Etablering av kandidat multiplex immunassays for analyser av feltprøver
I AP3 vil man gå videre med kandidat multiplex-assays etablert i AP2 for analyser av feltprøver. Aktiviteter vil konkretiseres i samarbeid med næringen.

3.1. Validering på prøver fra felt.
3.2. Resultater vurderes opp mot fiskens velferdsstatus og sykdomsatferd.
3.3. Implementering av metoden i feltlaboratorium.
3.4. Utprøvning av fullblodsprøver (pilot).
 
Prosjektorganisering
Forsøket i AP 1.1 vil planlegges og utformes av NMBU i samråd med VESO Vikan og prosjektets styringsgruppe. Selve smitteforsøket og prøvetaking vil bli utført på VESO Vikan. Analyser av gen-ekspresjon ved RT PCR vil bli utført av NMBU. Plasma proteomikk analyser vil utføres ved Laboratory of Biomedical Microbiology and Immunology (LBMI) ved Universitetet for Veterinær medisin og farmakologi i Košice, Slovakia, gjennom etablert samarbeid med David Eckersall.

AP 1.2 og 1.3 utføres av NMBU. AP 1.4 (produksjon av antistoffer) vil settes ut til et eksternt firma dersom denne strategien er mest økonomisk (Vertebrate Antibodies Ltd., University of Aberdeen).

I AP2 er fokus på etablering av multiplex immunassays, og dette vil hovedsakelig utføres av NMBU i et samarbeid mellom immunologi-gruppen og velferds-gruppen i prosjektet. I denne arbeidspakken vil man ta utgangspunkt i materiale innsamlet i AP 1.1, og fra tidligere og pågående prosjekter som “Development of tools for assessment of the immune competence of Atlantic salmon smolts and growers (ImCom)” (Forskningsrådets prosjektnr. 267644), “Fish Virus Vaccines (ViVaFish)” (Forskningsrådets prosjektnr. 237315), “Coping with new environments and production methods: Animal welfare and stress biology applied to modern salmon farming (Newcope)” (Forskningsrådets prosjektnr. 267788), samt representativt feltmateriale.

I AP3 man vi implementere teknologien for analyser av prøver fra felt. Denne arbeidpakken vil utføres i tett dialog og samarbeid med næringen, og spesielt med Marine Harvest som vil bidra i prosjektet. NMBU er også samarbeidpartner i Blue Revolution Centre-satsingen til Marine Harvest, og prosjektgruppen ønsker i stor grad å knytte prosjektet opp mot denne plattformen.
Det bli gitt presentasjoner av prosjektet og resultatene på sentrale norske og utenlandske konferanser; FriskFisk2019 og 2021, European Association of Fish Pathologists sin konferanse EAFP 2019 og Programkonferansen Havbruk2020.

En populærvitenskapelig artikkel planlegges presentert i Norsk Fiskeoppdrett eller tilsvarende sommer 2020, og ved prosjektslutt høst 2021.

Foruten sluttrapport, tar prosjektet sikte på å levere to vitenskapelige artikler, som vil søkes sendt til åpne vitenskapelige tidsskrift. I tillegg forventes det parallelt publikasjoner fra eksisterende prosjekter (Imcom, Newcope), der multiplex immunassayene kan benyttes for analyse av innsamlet materiale.
keyboard_arrow_up