Prosjektnummer
901672
Karakterisering, prediksjon og reduksjon av kardiomyopatisyndrom (CMS) hos atlantisk laks (SALMOCARD)
Ny kunnskap om utvikling av CMS (kardiomyopatisyndrom)
• Skadene i hjerte på fisk med CMS relateres i større grad til fiskens immunrespons enn til direkte vevskade på grunn av virus-replikasjon.
• Immunnevroendokrin fenotype (INP)-data gav ikke gode svar på hvilke individer som fikk mye eller lite hjerteskader.
• Resultatene indikerer at PMCV-infeksjon er assosiert med stivhet i ventrikkelen og økt blodtrykk noe som kan være med å forklare hvorfor hjerte ofte sprekker ved CMS.
• L-plastin-nivåer både i blod og hjertet er assosiert med graden av histopatologisk skade i hjertet og dødelighet under CMS. Imidlertid er det ennå ikke fastslått om L-plastin kan brukes som en prediktiv og/eller prognostisk biomarkør for CMS-alvorlighetsgrad.
• Immunnevroendokrin fenotype (INP)-data gav ikke gode svar på hvilke individer som fikk mye eller lite hjerteskader.
• Resultatene indikerer at PMCV-infeksjon er assosiert med stivhet i ventrikkelen og økt blodtrykk noe som kan være med å forklare hvorfor hjerte ofte sprekker ved CMS.
• L-plastin-nivåer både i blod og hjertet er assosiert med graden av histopatologisk skade i hjertet og dødelighet under CMS. Imidlertid er det ennå ikke fastslått om L-plastin kan brukes som en prediktiv og/eller prognostisk biomarkør for CMS-alvorlighetsgrad.
Sammendrag av resultater fra prosjektets faglige sluttrapport (English summary further below)
Results achieved
Summary of results from the project’s final reporting
Kardiomyopatisyndrom (CMS) manifesterer seg som plutselig dødelighet uten tidligere tegn på sykdom. Årsaken og opprinnelsen til betennelsen og vevsskaden observert ved CMS er stort sett ukjent, og man mangler biomarkører som pålitelig kan forutsi dødsrisiko og patologisk skade. I dette prosjektet utforsket man om endringer i hjertet sett ved CMS skyldes 1) skade forårsaket av vedvarende virusreplikasjon og/eller 2) vertsindusert immunpatologi forårsaket av virusspesifikke immunceller (AP1).
I et storskala kontrollert eksperiment hvor fisk ble eksperimentelt infisert med PMCV, peker resultatene i prosjektet på en vedvarende antiviral og pro-inflammatorisk respons i hjertene til fisk som responderer på infeksjon med høy grad av histopatologisk skade (HR – high responders). Dette skjer selv etter at virusmengde er betydelig redusert, noe som antyder at alvorlighetsgraden av CMS kan være mer relatert til immunpatologi forårsaket av infiltrerende leukocytter snarere enn direkte skade på grunn av vedvarende virusreplikasjon. I tillegg var den initiale økningen i PMCV-transkripter i hjertene til HR 9 uker etter PMCV-infeksjon forbundet med et høyere uttrykk av kjemokiner og cytokiner, en sterkere antiviral respons og en større tendens til å utvikle alvorlige lesjoner sammenlignet med fisk med lav grad av histopatologisk skade (LR – low responders). Dette er også i tråd med de negative effektene av en langvarig type 1-immunrespons. Resultatene indikerer også at innføring av stress etter eksperimentell infeksjon resulterer i et annet sykdomsforløp sammenlignet med tidligere PMCV-infeksjonsforsøk. Mer presist ser det ut til at stress etter infeksjon forlenger histopatologien til tross for synkende virusmengder.
I et storskala kontrollert eksperiment hvor fisk ble eksperimentelt infisert med PMCV, peker resultatene i prosjektet på en vedvarende antiviral og pro-inflammatorisk respons i hjertene til fisk som responderer på infeksjon med høy grad av histopatologisk skade (HR – high responders). Dette skjer selv etter at virusmengde er betydelig redusert, noe som antyder at alvorlighetsgraden av CMS kan være mer relatert til immunpatologi forårsaket av infiltrerende leukocytter snarere enn direkte skade på grunn av vedvarende virusreplikasjon. I tillegg var den initiale økningen i PMCV-transkripter i hjertene til HR 9 uker etter PMCV-infeksjon forbundet med et høyere uttrykk av kjemokiner og cytokiner, en sterkere antiviral respons og en større tendens til å utvikle alvorlige lesjoner sammenlignet med fisk med lav grad av histopatologisk skade (LR – low responders). Dette er også i tråd med de negative effektene av en langvarig type 1-immunrespons. Resultatene indikerer også at innføring av stress etter eksperimentell infeksjon resulterer i et annet sykdomsforløp sammenlignet med tidligere PMCV-infeksjonsforsøk. Mer presist ser det ut til at stress etter infeksjon forlenger histopatologien til tross for synkende virusmengder.
Videre karakteriserte prosjektet hjertefunksjon og morfologi under et CMS-utbrudd i felt for å studere CMS-patogenese under autentiske forhold, men også for å teste om visse aspekter av CMS-patogenesen avhenger ikke bare av virus og/eller vedvarende immunopatologi, men også av stressende intervensjoner i akvakultur (AP2). For å adressere dette ble ekkokardiografi brukt til å vurdere hjertefunksjon hos fisk fra en PMCV-infisert kohort som ble sendt til slakt på grunn av høy dødelighet og sammenlignet med frisk, ikke-infisert fisk fra et kommersielt anlegg klar for slakt. Data i prosjektet indikerer at CMS-utbrudd i felt er assosiert med ventrikkelstivning og særlig økt diastolisk blodtrykk. Stress, som under trengsel hvor hjertebelastningen er økt, forverrer trolig den observerte fenotypen, og prosjektgruppen tror at dette kan drive diastolisk blodtrykk opp til et nivå som forårsaker atrieruptur (hjertesprekk) og dermed dødelighet.
Til slutt hadde prosjektet som mål å identifisere hjertebiomarkører for CMS-assosiert dødelighet før slakt (AP3). Man testet L-plastin spesifikt, siden foreløpige data viste at L-plastin var økt i blodplasma fra fisk som døde etter mekanisk avlusing under et CMS-utbrudd. Resultatene indikerer at nivåer av sirkulerende L-plastin og L-plastin i hjertevev er assosiert med dødelighet under CMS. CMS dødelighet er videre assosiert med alvorlige lesjoner i hjertevev med høy grad av infiltrerende immunceller, som indikerer at L-plastin frigjøres direkte fra celler i hjertet til sirkulasjon. Man fant forhøyede sirkulerende nivåer av L-plastin i kompleks i kombinasjon med reduserte monomere L-plastin-nivåer. Plasma nivå av L-plastin og spesielt forholdet mellom kompleksert og monomert L-plastin, kan tjene som en biomarkør for grad av histopatologisk skade i hjertet ved PMCV infeksjon og for CMS-assosiert dødelighet. Det er fortsatt usikkert om L-plastin kan fungere som en prognostisk biomarkør som kan forutsi CMS-assosiert dødelighet, og dette vil undersøkes nærmere i avsluttende studier og i videre prosjekter.
I tillegg ble proteomikk-analyser utført på blodplasmaprøver fra eksperimentell PMCV-infeksjon (AP1) og feltprøver (AP2) for å identifisere andre biomarkører for CMS. Proteomikk-analysen identifiserte flere proteiner som var forhøyet i PMCV-smittet fisk i felt sammenlignet med kontroller, og i smittet fisk versus fisk fra før smitte i eksperimentelle forsøk, men man fant ingen signifikante forskjeller i protein nivåer mellom HR og LR grupper. Proteinkandidater identifisert i både prøver fra felt og eksperimentelle karforsøk og/eller som har en tentativ rolle i CMS patogenesen, er lovende mål for videre evaluering som potensielle prognostiske og diagnostiske biomarkører for CMS.
Results achieved
Summary of results from the project’s final reporting
Cardiomyopathy syndrome (CMS) manifests as a sudden mortality outbreak without prior signs of illness. The nature and origin of inflammation and tissue damage observed in CMS are largely unknown and biomarkers that can reliably predict mortality risk and pathological damage are lacked. In the present project, it has been explored whether myocardial changes seen with CMS are caused by 1) damage caused by persistent virus replication and/or 2) host-induced immunopathology caused by virus-specific immune cells (AP1).
From a large-scale controlled experiment where fish were experimentally infected with PMCV, the results indicate persistent anti-viral and pro-inflammatory response in the hearts of fish with a high (HR) degree of histopathological damage even upon reduction of virus load, suggesting that the severity of CMS may be more related to immunopathology caused by infiltrating leucocytes rather than the direct damage due to persistent viral replication. In addition, the initial increase in PMCV transcripts in the hearts of HR at 9 weeks post PMCV infection was associated with a higher release of chemokines and cytotoxins, a stronger antiviral response, and a greater tendency to develop severe lesions compared to in fish with a low (LR) degree of histopathological damage, indicating the negative effects of a prolonged type I immune response. The experimental infection trail also indicates that introducing stress following experimental infection, result in a different disease trajectory compared to previous PMCV infection trials. More precisely, stress exposure post infection appears to prolong histopathology despite declining viral loads.
From a large-scale controlled experiment where fish were experimentally infected with PMCV, the results indicate persistent anti-viral and pro-inflammatory response in the hearts of fish with a high (HR) degree of histopathological damage even upon reduction of virus load, suggesting that the severity of CMS may be more related to immunopathology caused by infiltrating leucocytes rather than the direct damage due to persistent viral replication. In addition, the initial increase in PMCV transcripts in the hearts of HR at 9 weeks post PMCV infection was associated with a higher release of chemokines and cytotoxins, a stronger antiviral response, and a greater tendency to develop severe lesions compared to in fish with a low (LR) degree of histopathological damage, indicating the negative effects of a prolonged type I immune response. The experimental infection trail also indicates that introducing stress following experimental infection, result in a different disease trajectory compared to previous PMCV infection trials. More precisely, stress exposure post infection appears to prolong histopathology despite declining viral loads.
Further, the project characterized cardiac function and morphology during a CMS outbreak in the field to study CMS pathogenesis under authentic conditions but also to test whether certain aspects of CMS pathogenesis depend not only on virus and/or persistent immunity-induced immunopathology but also on cardiac remodeling caused by stressful operational practices in aquaculture (AP2). To address this, echocardiography was used to assess cardiac morphology and function in fish from a PMCV-infected cohort that was sent to slaughter due to high mortality and compared to healthy non-infected fish from a commercial sea pen ready for slaughter. Our data indicate that CMS outbreaks in the field is associated with ventricular stiffening and increased diastolic blood pressure. Stress, such as during crowding where cardiac demand is increased, likely exacerbates the phenotype observed, and the project group believes that this can drive diastolic blood pressure up to a level that causes atrial rupture and thereby mortality.
Lastly, the project aimed to develop an assay to measure cardiac biomarkers of pre-slaughter mortality (AP3). L-plastin as a potential biomarker was specifically tested since the preliminary data showed that L-plastin was also increased in blood plasma collected from fish that died following mechanical de-lousing during a CMS outbreak. The results indicate that circulating and cardiac L-plastin levels are associated with mortality during CMS. In turn, CMS mortality is related with severe myocardial lesions harboring L-plastin in immune cell infiltrates indicative of L-plastin being released directly from the heart into the blood stream. Thus, elevated circulating levels of complexed L-plastin in combination with reduced monomeric L-plastin levels, and especially the ration between these two, may serve as a biomarker of the level of inflammation in the PMCV infected heart and possibly the mortality risk during CMS in farmed salmon. However, whether L-plastin can be used as a predictive and/or prognostic biomarker of CMS severity is yet to be determined.
In addition, proteomic analyses were performed on blood plasma samples from experimental PMCV-challenge trial (AP1) and field samples to identify the most promising biomarkers. The proteomics analysis identified several proteins that were elevated both in deceased versus surviving fish in the field and in high versus low responders from the experimental trial. Candidates for antibody production were selected based on results from the plasma proteomics study and on their putative roles in cardiac damage and remodeling. These proteins serve as promising targets for evaluation as potential prognostic and diagnostic biomarkers of CMS in future projects.
Prosjektet har definert høyrespondere som fisk med mye patologi og resulatene viser derfor lite nytt i forhold til tidligere studier der klassisk histopatologi er anvendt. L-plastin kan bli en ny biomarkør for CMS, men videre FoU er nødvendig.
-
Norges miljø- og biovitenskapelige universitet (NMBU). 14. mars 2025. Av Ida Beitnes Johansen (Institutt for prekliniske fag og patologi (PREPAT), Veterinærhøgskolen, NMBU), Hege Lund (PREPAT, Veterinærhøgskolen, NMBU), Simona Kavaliauskiene (PREPAT, Veterinærhøgskolen, NMBU) og Michael Frisk (Institutt for eksperimentell medisinsk forskning, Ullevål Universitetssykehus).
Kardiomyopatisyndrom (CMS) er en alvorlig hjertesykdom hos atlantisk laks (Salmo salar). I løpet av det siste tiåret har det blitt en av de viktigste årsakene til sykdom og dødelighet i norsk oppdrettsnæring. Forståelse av patofysiologien som ligger til grunn for denne sykdommen samt nye, nøyaktige diagnostiske verktøy for å vurdere dødelighetsrisiko er derfor svært etterspurt av havbruksnæringen. Til tross for betydelig forskningsinnsats de siste tiårene, er det store kunnskapshull i vår forståelse av patogenesen som ligger til grunn for CMS. Spesielt er forståelsen av interaksjoner mellom laksens fysiologi og immunrespons i utvikling av sykdommen og alvorlighetsgrad av sykdommen dårlig forstått. Selv om sykdommen utløses av piscint myokardittvirus (PMCV), fører ikke PMCV-infeksjon nødvendigvis til klinisk CMS. Derfor er kunnskap om hvordan og hvorfor PMCV induserer CMS hos noen individer, men ikke hos andre, avgjørende for å løse sykdomsproblemet og for å utvikle forebyggende verktøy. Prosjektet vil jobbe etter hypotesen at individuell variasjon i stress- og immunresponsivitet (immun-nevroendokrin fenotype) kan forklare variasjonen i sårbarhet for CMS.
1. Å identifisere immun-nevroendokrine fenotyper (INP-er) av laks som er sårbare for å utvikle CMS.
2. Å undersøke om utvikling av CMS skyldes virus-indusert skade eller immun-patologi hos verten.
3. Å utvikle pålitelige biomarkører for CMS-relatert dødelighetsrisiko.
2. Å undersøke om utvikling av CMS skyldes virus-indusert skade eller immun-patologi hos verten.
3. Å utvikle pålitelige biomarkører for CMS-relatert dødelighetsrisiko.
CMS-relatert sykdom og dødelighet kompromitterer både operativ økonomi og fiskevelferd. Plutselig stressrelatert dødelighet av stor fisk like før slakt er spesielt bekymringsfullt. SALMOCARD vil frembringe kunnskap og verktøy som er nødvendige for å redusere slikt produksjonstap. For det første vil oppdrettere få kunnskap og nye avlsmål for utvelgelse av fenotyper som er resistente mot utvikling av CMS (og kanskje også andre patogener). For det andre vil personell, som arbeider med biosikkerhet og problemer knyttet til håndtering av CMS ute på oppdrettsanlegg, få verktøy og kunnskap som er avgjørende for å kontrollere sykdommen på en betydelig bedre måte enn i dag og for å vurdere risikoen for sykdommen i produksjonsplanleggingen. SALMOCARD vil utvikle biomarkører som kan brukes på stedet for pålitelig prediksjon av CMS-relatert dødelighet.
Prosjektet er inndelt i tre arbeidspakker (AP-er):
AP 1: Tidlige indikatorer for CMS-sårbarhet og alvorlighetsgrad
Ansvarlig: NMBU v/ Ida Beitnes Johansen
I denne arbeidspakken skal det undersøkes om forskjellige immunoneuroendokrine fenotyper (INP-er) eksisterer og om de kan forutsi CMS-patogenesen hos atlantisk laks. I så fall kan INP fungere som tidlig indikator for sårbarhet for alvorlig CMS-patogenese. For dette skal det gjøres eksperimentelle PMCV-infeksjoner i en gruppe fisk (n=300) der en samtidig karakteriserer stress- og immunresponsivitet hos alle individer. Fisken vil gjennomgå gjentagende stresstester for å vurdere stress-responsivitet (kortisol) og immun-responsivitet vurderes etter vaksinering. For å karakterisere immun-responsivitet vil man undersøke ikke-spesifikke antistoffresponser samt et stort panel med immungener (ved hjelp av såkalt multiplex gene expression assay (MGE), Fluidigm Biomark® HD) med vekt på Th1 (f.eks. IFNs (IFNa, b, c) og IFNγ, IL-2, 6, 12 og 18) versus Th2 (f.eks. INF 4 og 10)-polarisering av responsen. Etter virus-infeksjon vil det overvåkes sykdomsutvikling hos grupper av fisk på tidspunkter før, under og etter forventet virustopp.
AP 2: CMS i fisk som dør i oppdrett før slakt
Ansvarlig: UiO v/ Michael Frisk
Eksperimentelle PMCV-infeksjoner fremkaller typisk ikke like alvorlig hjertepatologi og dødelighet slik det observeres i felt. Dette indikerer at miljøforhold og stressende inngrep i produksjon av laks kan bidra til utviklingen av alvorlig hjertepatologi og CMS-dødelighet. Siden individuelle INP-er sannsynligvis påvirker i hvor grad slike miljøfaktorer innvirker på CMS-patogenesen, er det sentralt å identifisere INP-er og CMS-alvorlighetsgrad under autentiske akvakulturforhold. I denne arbeidspakken skal en derfor ta ut prøver fra laks fra minst fem forskjellige oppdrettsanlegg med bekreftet klinisk CMS-utbrudd. En rekke prøver fra andre pågående prosjekter vil dessuten brukes som negative kontroller i denne arbeidspakken. Alle hjerter vil bli underlagt molekylære (basert på AP1), morfologiske og histologiske undersøkelser for å knytte sykdomsutvikling til INP. I alle oppdrettsanlegg forventer man å identifisere to kontrastgrupper: 1) Fisk med alvorlig hjertesykdomsprogresjon, inkludert fisk som dør av hjertesprekk og 2) Fisk med PMCV-infeksjon, men uten kliniske symptomer på CMS. Disse kontrastgruppene vil bli identifisert ved å ta prøver av fisk før og etter en avlusning. For å indikere hjertesykdomsprogresjon hos individer som blir prøvetatt før avlusing, vil hjertefunksjonen bli vurdert ikke-invasivt ved hjelp av ekkokardiografi.
AP 3: Biomarkører for CMS-relatert dødelighet
Ansvarlig: NMBU v/ Hege Lund
Biomarkører er avgjørende for diagnostikk, hjerteforskning og behandling av hjertesykdom hos mennesker. Hjertetroponiner (cTn) I, T og C er biomarkører for hjerteskade siden de frigjøres i blodsirkulasjonen fra skadede hjerteceller (kardiomyocytter). L-plastin er en ofte brukt betennelsesmarkør hos pattedyr og en validert leukocyttmarkør hos fisk. Man har preliminære data fra et pågående FHF-finansiert prosjektet “Etablering av multiplex immun-assays for måling av biomarkører for helse og velferd hos Atlantisk laks (Salm-Plex)” (FHF-901462) som indikerer at CMS-relatert dødelighet er assosiert med økte plasmanivåer av L-plastin, så denne kandidaten skiller seg ut som en spesielt lovende biomarkør. I denne arbeidspakken vil det utvikles verktøy for å måle hjertetroponiner og L-plastin og validere biomarkøranalysene ved hjelp av blodprøver fra AP1 og 2. I tillegg vil man gjøre “shot-gun” plasmaproteomikk i samarbeid med SINTEF for påvisning av nye hjertebiomarkører. Prøver vil bli valgt fra fisk med og uten bekreftet CMS-relatert hjertepatologi i AP1 og 2.
Arbeidsmøter (workshops) med samarbeidspartnere og brukere som er involvert i prosjektet vil bli organisert minst to ganger (foreløpig i 2021 og 2023). Første møte planlegges i samarbeid med andre pågående prosjekter innen området hjertehelse. Det er også et tydelig innovasjonspotensial i prosjektet. Spesielt åpner utviklingen av validerte biomarkører for hjertesykdom og skade (AP3) for kommersialisering av prosjektresultatene. Prosjektresultater vil bli delt med det vitenskapelige miljøet og havbruksnæringen på nasjonale og internasjonale møteplasser for fiskehelse og velferd.
I tillegg til disse nasjonale konferansene, vil prosjektresultatene bli presentert på konferansen Aquaculture Europe for å nå et bredere publikum. Videre forventer man at prosjektresultatene ikke bare kommer til å interessere havbruksforskere, men også fysiologer, kardiologer, immunologer, endokrinologer og forskere innen biomedisin. For at resultatene skal nå de aktuelle vitenskapelige miljøene, vil resultatene også bli presentert på konferanser organisert av Scandinavian Physiological Society og Society for Experimental Biology, som allerede har en stor andel forskere fra et bredt spekter av disse fagene. Populærvitenskapelige rapporter fra det prosjektet vil bli utarbeidet for ulike nasjonale medier som Forskning.no og andre nyhetsmedier. Det er viktig at resultatene vil bli publisert i både generelle og spesialiserte vitenskapelige tidsskrifter, fortrinnsvis i tidsskrifter med åpen tilgang.
I tillegg til disse nasjonale konferansene, vil prosjektresultatene bli presentert på konferansen Aquaculture Europe for å nå et bredere publikum. Videre forventer man at prosjektresultatene ikke bare kommer til å interessere havbruksforskere, men også fysiologer, kardiologer, immunologer, endokrinologer og forskere innen biomedisin. For at resultatene skal nå de aktuelle vitenskapelige miljøene, vil resultatene også bli presentert på konferanser organisert av Scandinavian Physiological Society og Society for Experimental Biology, som allerede har en stor andel forskere fra et bredt spekter av disse fagene. Populærvitenskapelige rapporter fra det prosjektet vil bli utarbeidet for ulike nasjonale medier som Forskning.no og andre nyhetsmedier. Det er viktig at resultatene vil bli publisert i både generelle og spesialiserte vitenskapelige tidsskrifter, fortrinnsvis i tidsskrifter med åpen tilgang.
-
Norges miljø- og biovitenskapelige universitet (NMBU). 14. mars 2025. Av Ida Beitnes Johansen (Institutt for prekliniske fag og patologi (PREPAT), Veterinærhøgskolen, NMBU), Hege Lund (PREPAT, Veterinærhøgskolen, NMBU), Simona Kavaliauskiene (PREPAT, Veterinærhøgskolen, NMBU) og Michael Frisk (Institutt for eksperimentell medisinsk forskning, Ullevål Universitetssykehus).