Til innholdet

Prosjektnummer

901033

Prosjektinformasjon

Prosjektnummer: 901033
Status: Avsluttet
Startdato: 01.09.2014
Sluttdato: 09.09.2015

Hurtigmetoder for bestemmelser av enzymaktivitet og modningsgrad i jomfrusild (pelagisk)

Delprosjekt A – Enzymaktiviteter
Her er det utviklet en metode for bestemmelse av gelatin-nedbrytende enzymaktivitet, basert på måling av viskositetsendring i en gelatinløsning. Dette er en mye raskere metode, som krever minimalt med forbehandling og vesentlig kortere inkubering.
 
Metoden krever ingen kjemikalier utenom gelatin, utstyrsbehovet er minimalt og analysen kan gjennomføres på mindre enn halvparten av tiden til den opprinnelige standardmetoden.
 
Delprosjekt B – Modningsgrad
Her er et utvalg av disse indikatorproteinene analysert ved hjelp av avanserte kjemiske separasjons- og analyseteknikker (LC-MS), og identifisert. Man har nå identifisert et knippe av proteiner som vil kunne brukes for å utvikle en hurtigmetode, basert på ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), en test som bruker antistoffer for å påvise en forbindelse i en våt prøve eller væske.
 
Det er foretatt 2D gel-elektroforese separasjon av proteiner i 4 ulike prøver av råstoff og delvis modnet matjessild, fra forsøk utført i 2014. Resultatene viser at selv etter 9 timers modning, skilte proteinsammensetningen i muskel seg vesentlig fra sammensetningen i kommersielt modnet matjes (resultater fra 2012). Basert på resultatene fra disse forsøkene, samt forsøk utført i 2012 og 2013, ble det utvalgt en rekke proteiner som ble analysert ved hjelp av LC-MS. Ikke alle disse proteinene kunne identifiseres, men analysene gir grunnlag for utvelgelse av kandidater til identifikasjonsproteiner, som kan brukes i en utvikling av en hurtigmetode.
Prosjektet er så langt det siste av totalt 3 prosjekter. Gjennom prosjektperioden har det vært gjennomført flere serier med prøveproduksjon i både småskala forsøk og senere i større målestokk. De ferdig marinerte produktene fra den nye produksjonsprosessen er oversendt kunder i EU for videre test og grunnlag for kommersiell vurdering.
 
Resultatet har vekket stor interesse fra større aktører i viktige sildemarkeder i EU, og det jobbes videre med å videreutvikle prosessmetoden på bedriftsnivå. Hurtigmetoden for måling av enzymaktivitet har vært en viktig faktor for å kunne oppnå tilfredsstillende styring og kontroll av modningen underveis i produksjonsprosessen.
 
Sammen med nyutviklede produksjonsmetoder, kan disse analysene danne basis for nye produkter av nordsjøsild.
FHF-prosjektene vedrørende alternativ matjes-produksjon, har gitt beskrivelser av industrielle prosesser for produkter som var vakt betydelig interesse blant annet hos industrikunder i Tyskland og Ukraina. Ytterligere markedstilpasningsaktiviteter er på gang, og det planlegges regulær produksjon i kommende sesong. Egersund Seafood har dessuten søkt Innovasjon Norge (IN) om støtte til å gjennomføre et prosjekt for endelig markedstilpasning av jomfrusild-produktene til det tyske markedet. I den forbindelse er det planlagt en rekke forsøk med ulike laker som kan inngå som prøvemateriale i dette prosjektet.

Resultater fra forsøkene i FHF-prosjektene viser at salte og modningsprosessene er reproduserbare, men også at det gjenstår utfordringer knyttet til å måle enzymaktivitet og modningsgrad. Disse to parameterne viser seg å henge nøye sammen. Analysene som er gjennomført i prosjektet – i etterkant av produksjonen – er imidlertid tidkrevende og omstendelige og lite egnet for industrielle formål. Og det er et industrielt behov for enklere metoder.
 
Del A: Enzymaktivitet
I dette prosjektet vil man utvikle og dokumentere en metode som tar utgangspunkt i endringer i viskositet i en gelatinløsning. Tilsvarende tilnærming er brukt for å bestemme pectinaseaktivitet (Gusakov et al., 2002). Denne tilnærmingen reduserer behovet for kjemikalier og utstyr, forenkler målingene i forhold til de metodene som er brukt så langt i matjesprosjektene og forventes å kunne redusere analysetiden til noe over en time. En slik analyse vil være svært nyttig/nødvendig for å kunne produsere laker med jevnt enzymaktivitetsnivå – og dermed produkter med jevn kvalitet.

Når det gjelder hurtigmetoder for måling av enzymaktivitet, kjenner man ikke til at det er gjort arbeid som er relevant for denne prosessen. I FHF-prosjektet “Hurtig metode for å estimere buksprenging i pelagisk fisk om bord” (FHF-900656) er det utviklet en metode for å påvise proteolytisk aktivitet (Slizyte et al., 2013). Men denne metoden er for generell og ikke egnet til å vurdere modningslake, fordi man i modningsprosessen vil måle aktiviteten av enzymer som bryter ned bindevev.
 
Del B: Proteinnedbrytning/modning
Til å avdekke de proteinforandringer som skjer i sildemusklen under modningsprosessen ble det i prosjektene med alternativ matjes-produksjon ble det også målt nedbrytning av protein, ved hjelp av proteomanalyser (2D-gelanalyser). Disse forteller noe om hvordan muskelproteinene er blitt påvirket under matjesfremstillingen. En proteomanalyse består an en proteinprofil, som viser en prøves forskjellige proteiner adskilt etter ladning og størrelse. For en gitt prøve utgjør en slik proteinprofil et slags fingeravtrykk, som kan sammenlignes mellom forskjellige prøver og benyttes til å undersøke, hvilke prosesser som under forskjellige modninger er forskjellige og hvilke som ligner hverandre.

Resultatene fra 3 uavhengige forsøk (Skåra et al., 2013; Skåra et al., 2014) viser at det finnes et betydelig antall proteiner som er unike for de ulike prosessene. Med dagens analyseteknologi er det mulig å identifisere ett eller flere av disse, og det kan utvikles hurtigmetoder for å påvise dem som kan bli nyttige verktøy for industrien og redusere behovet for prosessovervåking og erfaringsbaserte vurderinger. Et ytterligere perspektiv av prosjektet vil være muligheten for at de ønskede modningsprosesser i sildemuskelen (filéten?) vil kunne avspeiles i endringer i laken, hvilket vil gjøre en fremtidig hurtigmetode betydelig lettere å gjennomføre, sammenlignet med at analysen skal gjennomføres på muskel.
 
Delprosjekt B har som målsetning å identifisere flere av disse proteinene; både for å finne mulige indikatorproteiner, men også for å forstå prosessen bedre.

Man er ikke kjent med at det er gjort noe på dette området innenfor modning av fisk, men i de senere år er det publisert en rekke artikler om dette temaet innfor modning av ost (Hinz et al., 2012) og skinke (Gallego et al., 2014). Den danske samarbeidspartneren i prosjektet, Danmarks tekniske universitet (DTU), har også identifisert flere proteiner som har sammenheng med tekstur i regnbue-ørret (Godiksen et al., 2009).

Prosjektet er forankret/koblet til flere av FHFs tverrgående strategiske satsingsområder 2012–2014:
• totalutnyttelse av fiskeråstoff
• konkurransekraft og effektivitet
• kvalitetskontroll med kvalitetsparametere
• markedsforskning
 
og dessuten til FHFs prioriteringer for industri pelagisk, som framhever utvikling av ny teknologi for automatisering, robotisering og bærekraftig produksjon av pelagisk fisk.

Utvikling av denne type analysemetoder vil bidra til å forbedre prosesskontrollen. Ny analyseteknologi vil redusere behovet for subjektive vurderinger, erfaringsbasert kunnskap og dessuten  bidra til jevnere produktkvalitet og bedre prosess-styring.

Prosjektet har solid forankring i Nofimas strategi, som vektlegger verdiskapning og utvikling av konkurransefortrinn for våre kunder.
Å oppnå bedre kontroll med modningsprosessen for jomfrusild gjennom utvikling av enkle hurtigmetoder for:
• enzymaktivitet (gelatinaseaktivitet)
• modningsindikatorer – Trinn 1

Metodene skal være lite tidkrevende og egnet for bruk i industrien.
Slike hurtigmetoder vil bidra til at industrien kan levere produkter av jevn kvalitet. Det vil bidra til å øke produktspekteret og forbedre kundetilpasninger for lettsaltede filétprodukter. Dette vil alle norske bedrifter som foredler nordsjøsild kunne dra nytte av. På lengre sikt vil det være nyttig også i foredling av kystsild eller norsk vårgytende sild (NVG-sild). Tilgang til denne type analyseverktøy vil bidra til å heve kompetansen i norsk sildeforedlingsindustri, noe som kan gi betydelige konkurransefortrinn med hensyn til utvikling/tilpasning av nye produkter.
 
I forhold til de mulighetene som dette kan gi er ressursbruken i dette prosjektet forholdsvis beskjeden. Prosjektet tar imidlertid fatt i de muligheter som åpner seg ved at det kan kjøres parallelt med et IN-prosjekt. Man tar sikte på å forfølge problemstillingen videre ved å søke om forskningsmidler fra f.eks. Norges forskningsråd, så snart det foreligger en egnet utlysning.
Produksjonsforsøkene som inngår i dette prosjektet planlegges finansiert av Egersund Seafood/Innovasjon Norge og består av følgende deler: 
 
Del A – Enzymaktivitet
Ansvarlig: Nofima
Hurtigmetoden som skal utvikles er basert på nedbryting av gelatin med en prøve av enzymholdig prøvemateriale (sloekstrakt/lake) og aktiveringsbuffer som inkuberes med substrat (gelatin). Enzymer i prøvematerialet nedbryter gelatinen og endrer dermed viskositeten. Dermed kan viskositetsendringen i gelatin-løsningen fungere som et indirekte mål for enzymaktivitet.
 
Utvikling av metode: Enzym- og viskositetsmålinger
I prosjektet måles enzymaktiviteten direkte ved hjelp av et proteinase assay (også anvendt i tidligere matjesprosjekter) som blant annet innebærer flere reaksjonstrinn, sentrifugering og avlesning i spektrofotometer, mens viskositet måles på et rheometer.
 
Optimalisering av metode: Test av ulike kombinasjoner
Hurtigmetoden som skal baseres på viskositetsmåling av gelatin må optimaliseres med hensyn til prøvemengde og –temperatur, samt være rask, nøyaktig og repeterbar. Dette krever utprøving av en rekke ulike kombinasjoner.
 
Databehandling, rapportering og prosedyre
Den endelige prosedyren må også dokumenteres gjennom et betydelig antall analyser for å estimere analyseusikkerhet, og utarbeide en enkel prosedyre.
 
Del B – Modningsgrad
Ansvarlig: Danmarks tekniske universitet (DTU)
Å komme i havn med en metode for denne delen er et lengre løp enn det man kan forvente at FHF/næringen skal fullfinansiere. Arbeidet i dette del-prosjektet (B) vil sammenstille resultatene fra 3 foregående forsøk, med forsøkene som planlegges i juni 2014 (IN-prosjektet), og sikre at man får trukket ut all informasjon fra disse resultatene, samtidig som man bringer arbeidet et skritt videre.
 
Protein- og dataanalyse nye forsøk (juni 2014)
30 prøver velges ut blant  muskel- og lakeprøver. Fra disse ekstraheres proteiner fra muskel (og evt. lake) som analyseres på 2D-geler. Det gjennomføres en dataanalyse på de 30 gelene slik som det ble gjort i tidlige matjesprosjekter.
 
Databehandling av alle data koblet til sensoriske data
Med utgangspunkt i disse data og proteomdata, samt resultater fra sensoriske analyser i de gjennomførte matjesprosjekter, velges det ut de beste egnede markører.
 
Identifikasjon av markører
Identifikasjon av disse markørene skjer ved hjelp av masse-spektroskopi. Proteiner skjæres ut av 2D-geler og fordøyes til peptider med trypsin. De fremkomne peptider analyseres med MS/MS (tandem mass spectrometry) og de de resulterende aminosyresekvenser benyttes til databasesøkninger for identifikasjon via sekvenshomologier.

Det planlegges to rapporter om henholdsvis enzymaktivitet og modningsindikatorer, faktaark og vitenskapelig artikkel. I tillegg vil det bli gitt en presentasjon for næringen.

keyboard_arrow_up