Til innholdet

Prosjektnummer

901484

Prosjektinformasjon

Prosjektnummer: 901484
Status: Avsluttet
Startdato: 01.03.2018
Sluttdato: 31.12.2020

Trenger laks fettsyren EPA for optimal immunrespons? (EPA-laks)

​Ny kunnskap om fettsyren EPAs effekt på laks som vil bidra til bedret fiskehelse gjennom fremtidig fôrutvikling
• EPA har gjennomgående effekter på inflammasjons- og immunrespons, men effektene er som forventet ikke like sterke som respons på immunstimuli.
• I leverceller ble det sett indikasjoner på en høyere inflammasjonsrespons ved økt EPA (økt cox2-uttrykk og prostaglandin-produksjon).
• EPA gav tydelige immunresponser i både hjerte- og fettceller. Effekten av EPA på virusrespons i hjerteceller kan være knyttet til endring i energimobilisering ved virusinfeksjon, mens effekten i fettceller var direkte relatert til immunrespons og tyder på en sterkere antiviral respons med EPA enn med oljesyre. Resultatene viser at celler fra begge disse vev kan benyttes som modeller for å studere interaksjonseffekter mellom fettsyrer og immunrespons.
• I ASK-cellelinjen fra laks gav økende nivåer av EPA i dyrkingsmediet en signifikant immunmodulerende rolle på respons ved virusinfeksjoner med ISAV og SAV3. Høyere nivåer av EPA reduserte responsen på de aller fleste gener som endret uttrykk ved infeksjonen. Dette indikerer en immundempende effekt av EPA. Det var lignende mønster i respons på levende virus og PolyI:C. Mange av de samme metabolske veiene ble påvirket i cellelinjen som i primærcellene, men retningen på responsen var en annen enn den sett i primærcellene. Hvorvidt dette er på grunn av metodikk (RNAseq vs qPCR) eller forskjeller i cellenes egenskaper er ikke klart.
• Respons på virus-mimikk (PolyI:C) var lignende den til SAV og ILAV i ASK-cellelinjen og vil derfor være et nyttig verktøy ved studier om generelle viruseffekter. Det virker også som om PolyI:C kan avdekke flere samspillseffekter mellom EPA og inflammasjon enn levende virus, muligens grunnet mer støy i resultatene ved bruk av levende virus.
• Prosjektet har gitt viktig kunnskap om forskjeller og likheter mellom bruk av ulike cellemodeller i analyse av immunrespons når ulike nivåer av EPA benyttes. Resultatene viser at både primærceller samt cellelinjer kan dyrkes i cellemedier med EPA og oppnå tilsvarende nivåer av EPA som i celler høstet direkte fra laks fôret med EPA. Med gode data fra fettsyresammensetning i ulike vev og fettfraksjoner fra fôringsforsøk vil det derfor være mulig å gjøre forsøk i fremtiden med celler tilsatt EPA og kunne diskutere dette opp mot gitte nivåer EPA i fôret.
​Sammendrag av resultater fra prosjektets faglige sluttrapport (summary in English further below)
Dette prosjektet har studert rollen til den viktige omega-3-fettsyren EPA (eicosapentaensyre) i inflammatoriske prosesser og immunrespons til atlantisk laks. Et fôringsforsøk med smoltifisert laks (110–446 gram) ble utført med dietter med økende EPA-nivå (0,9, 1,3, 2,2, 5,3 og 10,4 % EPA av totale fettsyrer) og stabilt nivå av DHA (docosahexaensyre), som resulterte i et stort spenn i ratio mellom DHA/EPA (henholdsvis 5,2, 3,5, 2,2, 0,9 og 0,5). Det var ingen forskjeller i vekst og fôrinntak mellom diettene, men store endringer i fettsyrer i vev (lever, hodenyre, hjerte, visceralfett og røde blodceller). EPA-nivåene økte i alle analyserte vev, både i polare og nøytrale fettfraksjoner, mens DHA holdt seg stabilt. Spesielt interessant var en økning i ratio mellom EPA og ARA (arakidonsyre) i polare lipider, som vil kunne være viktig for inflammatorisk respons grunnet mulige endringer i eikosanoid-produksjon i ulike vev. EPA og ARA er substrat for produksjon av henholdsvis anti-inflammatoriske og pro-inflammatoriske eikosanoider. En endring i denne balansen kan derfor endre den inflammatoriske statusen til fisken. Celler fra hodenyre, lever og hjerte ble høstet fra fisken ved slutten av fôringsforsøket. Disse cellene ble så brukt til celleforsøk hvor de ble eksponert for immunstimuli av bakterie- eller virus-mimikk (henholdsvis LPS eller PolyI:C). I tillegg ble hodenyre og leverceller dyrket i ko-kultur, for å se på eventuelle interaksjoner mellom de to celletypene. Alle cellemodellene viste klare immunresponser i henhold til tidligere studier, mens effekten av EPA i de ulike modellene ikke var like utpreget. EPA påvirket uttrykket av gener involvert i oksidativt stress (catalase), inflammasjon (cox2) samt det medfødte immunforsvaret (tlr). Alle disse genene viste en økning ved økt EPA i fôr og vev. Det var også EPA-effekter på mengden eikosanoider som ble målt i cellemedier fra studiene med leverceller, med en generell økning i nivå av eikosanoider av omega-3- og omega-6-opphav med økt EPA i fôret (PGE3 og PGE2). Disse resultatene tyder derfor på en endring i inflammasjonsstatus ved økt EPA i fôret, men det er vanskelig ut ifra disse resultatene å vite om den går mot en mer pro- eller anti-inflammatorisk situasjon.

Det ble også gjort forsøk med primærceller (hjerte- og fettceller) høstet direkte fra fisk fôret med vanlig kommersielt fôr som så ble dyrket i vekstmedium tilsatt EPA. Disse cellene nådde lignende eller høyere EPA-nivåer sammenlignet med cellene høstet fra fôringsforsøket. I fettcellene ble effekten av EPA sammenlignet med oljesyre, en en-umettet fettsyre som er vanlig i planteoljer. Disse studiene ga også informasjon om respons på ulike tidspunkt etter immunstimuli. I hjertecellene var det størst effekt av immunstimuli på genuttrykk etter 2 dager, mens den var størst i fettceller etter 4 dager. EPA har i tidligere forsøk vist seg å ha en effekt i fasen etter den første immunresponsen, i resolusjonsfasen, og denne informasjonen er derfor viktig for videre studier. I hjertecellene ga EPA ingen endring i respons på typiske immungener etter PolyI:C stimuli, men effekter av EPA ble sett på fettmetabolismen. Dette kan være knyttet til en økt energimobilisering i forbindelse med håndtering av virus. I fettcellene ga EPA generelt sett flere effekter på genuttrykk enn den en-umettede fettsyren oljesyre. I tillegg viste fettcellene med EPA generelt høyere uttrykk av gener relatert til adaptiv immunitet etter PolyI:C stimuli enn hva som ble sett i cellene tilsatt oljesyre. Det er derfor vist at det er mulig å finne effekter av EPA på inflammasjonsrespons også i celler som er dyrket med EPA. Med grunnleggende informasjon om fettsyrer i ulike vev gitt ulike nivåer med EPA (som rapportert fra fôringsforsøket) er det derfor mulig å modellere inflammasjonseffekter av spesifikke nivå av EPA i diett uten å nødvendigvis måtte gjøre et fôringsforsøk av fisk i forkant.

Et siste modellsystem var en cellelinje (ASK), altså celler som deler seg i kultur og holdes i live i laboratorium. Fordeler med slike celler er at en ikke er avhengig av levende fisk for å skaffe celler ved nye forsøk og at forsøk i større grad blir sammenlignbare fra gang til gang grunnet fravær av individeffekter. Disse cellene ble også dyrket i cellemedium med tilsatt EPA og nådde høye nivåer av EPA i cellene, tilsvarende som sett i fisk fra fôringsforsøket og høyere. En gradient i EPA-nivå ble brukt her, noe som gjør det mulig å forutse hvilke nivåer av EPA en får i cellene ved ulike nivåer i cellemedier. Forsøk med cellelinjen viste at respons på PolyI:C og to levende virus (ILA-virus og PD-virus (SAV3)) var relativt like og bekreftet at effektene av EPA var små sammenlignet med effekter av immunstimuli. Cellelinjen ga noe ulike resultater fra de øvrige cellemodellene ved at EPA her viste en generell immundempende effekt, og ikke en økning i slike gener som sett i primærcellene. Disse resultatene er mer i tråd med hva som er sett in vivo ved høy EPA i diett etter virussmitte. En immundempende effekt vil muligens være nyttig i situasjoner med virus-infeksjoner som gir høy inflammasjon i vev og redusert velferd og helse hos fisk grunnet denne virusresponsen. Grunnen til at en annerledes tendens er sett i cellelinjer enn i primærcellene kan være at RNA-sekvensering ble brukt som metode for genuttrykk, og dette viser et større bilde enn ved qPCR som er brukt i noen av de andre modellene.

Prosjektet har vist at EPA påvirker cellenes inflammasjonsrespons samt komponenter av både det medfødte og adaptive immunsystemet. EPA-effekter var allikevel små sammenlignet med responser på immunstimuli. Å kunne se effekter av EPA på inflammasjons- og immunrespons vil derfor være avhengig av å ha god resolusjon (altså optimal forsøksdesign og nok replikater). Bruk av inflammasjonsstimuli som kan aktivere en mer målrettet og øyeblikkelig respons vil også kunne gi mindre variasjoner mellom de ulike cellenes respons. Eksempler på dette er modellstimuli som PolyI:C og LPS som aktiverer immunforsvaret uten å skade cellene. Bruk av metoder som gir en bredere oversikt over metabolismen og immunresponsen, slik som transkriptom-analyse, kan være essensielt sammenliknet med kun analyse av enkeltgener ved qPCR.

Results achieved
Summary of results from the project's final report
This project has studied the role of the important omega-3 fatty acid EPA (eicopentanoic acid) in inflammatory processes and immune response in Atlantic salmon. A feeding trial with smoltified salmon (110–446 gram) was performed with diets containing increasing levels of EPA (0.9, 1.3, 2.2, 5.3 and 10.4 per cent of total fatty acids) and stable DHA. This led to a large range in the ratio between DHA/EPA (5.2, 3.5, 2.2, 0.9 and 0.5). There were no differences between dietary treatments in growth or feed intake, but large changes were seen in fatty acid composition of the tissues (liver, head kidney, heart, visceral fat and red blood cells). The EPA levels increased in all analysed tissues, both in polar and neutral fractions, while DHA kept stable. Especially interesting was an increase in the ratio between EPA/ARA in the polar lipids, which could be important for inflammatory response due to effects on eicosanoids production. Cells from head kidney, liver and heart were harvested from the fish at the end of the feeding trial. These cells were exposed to immune stimuli in the form of bacterial- or viral mimics (LPS and PolyI:C, respectively). In addition, head kidney and liver cells were grown in co-culture, to study interactions between the cells. All cell models showed clear immune responses, in accordance to earlier studies, while the effects of EPA were smaller. EPA affected genes involved in oxidative stress (catalase), inflammation (cox2) in addition to the innate immune system (tlr). All these genes showed an increase with increased EPA in feed and tissues. There were also effects on the amount of eicosanoids measured in cell media of the liver cells. There was a general increase in eicosanoids of both omega-3 and omega-6 origin with increased EPA in the diets (PGE3 and PGE2). The project group can therefore conclude that EPA might led to a change in inflammatory status of the fish, but it cannot say for certain if it leads to fish in a more pro- or anti-inflammatory direction.

Trials were also done with primary cells (heart and adipose cells) harvested from fish fed a normal commercial feed and then grown in media containing EPA. These cells reached similar levels of EPA, or higher, compared to the cells harvested from the feeding trial. In the adipose cells, the effect of EPA was compared to oleic acid, a mono-unsaturated fatty acid common in plant oils. These studies also gave the project group knowledge on the immune response in different times after an immune response. In the heart cells the largest effects on gene expression were seen two days after immune stimulation, while it in adipose cells was seen at finalization of the trial, four days after stimulation. EPA has in earlier trials indicated effects in the resolution phase after a viral infection, and this type of information is therefore important for future studies. In the heart cells, EPA gave no additional effect on the immune genes after the PolyI:C stimuli but affected genes in the lipid metabolism. This might be connected to an increased energy mobilization related to viral response. In the adipose cells, EPA gave more effects on gene expression than oleic acid. In addition, EPA led to a generally higher expression of genes related to adaptive immunity after PolyI:C stimuli, than what was seen in the cells grown with oleic acid. It is thus shown that it is possible to find effects of EPA on inflammatory response also in cells grown with EPA. With basic information on fatty acids in tissues given different EPA levels (as reported from the current feeding trial), it is therefore possible to model dietary EPA/ inflammation interaction effects in cells without necessarily having to do a feeding trial with fish first.

A last model system was a cell line (ASK), thus being cells that divide in culture and are held alive in a laboratory. Advantages with such cells is that you are not depending on live fish for obtaining cells for new trials. Another advantage is more comparable results between trials, due to lack of individual effects. These cells were also grown with EPA in the media and reached high EPA levels, comparable and even higher than in the cells harvested from the feeding trial. A gradient in EPA was used and it is therefore possible to use the produced information from this project to predict how different media EPA affects cell EPA content. This can be useful for future studies on EPA using ASK cells. Trials with the cell line showed that the response to PolyI:C and to live viruses (ISAV and SAV3) was relatively similar. This model also confirmed that the EPA-effects were quite small compared to the response to the immune stimuli. The results from this model deviated from the other models by showing a general immune-depressing effect of EPA, not an increase in immune-related genes, as seen in the other models. The results obtained in the cell line is in line with what has been seen in vivo with high EPA in diets after a viral challenge. The reason for these differences can be that RNA sequencing was used as a method for gene expression here and this will show a much wider picture of the response than qPCR, which was used in several other models.

This project has shown that EPA affects the inflammatory response of the cells as well as affecting components of both the innate- and adaptive immune system. The effects of EPA were, however, small compared to responses to immune stimuli. The ability to detect EPA-effects is therefore dependent on high resolution (i.e. optimal trial design and enough replicates). Also, the use of inflammatory responses that activates a more immediate and targeted response can help reduce variation in response between cells. Examples of stimuli with those properties are model stimuli like LPS and PolyI:C, which activate the immune response without harming the cells. Use of methods for a wider view of the metabolism and immune response, such as transcriptome analyses, might be essential compared to the analyses of single genes by qPCR.
​Prosjektet har gitt ny kunnskap om rollen til den viktige fettsyren EPA i oppdrettslaksens immunkompetanse, samt bidratt med viktige erfaringer knyttet til bruk av ulike cellemodeller som erstatning for ernæringsforsøk med bruk av levende laks.


  • Sluttrapport: Trenger laks fettsyren EPA for optimal immunrespons?
    Havforskningsinstituttet. 16. mars 2021. Av Nina Liland, Nini H. Sissener, Tone-Kari K. Østbye (Nofima), Tor Gjøen (Universitetet i Oslo), Marta M. Bou (Nofima), Elisabeth Holen, Bente Ruyter (Nofima), Aleksei Krasnov (Nofima), Esmail R. Lutfi (Nofima), Marit Espe, Ingunn Stubhaug (Skretting ARC) og Grethe Rosenlund (Skretting ARC).
Begrenset tilgang på fiskemel og fiskeolje gjør at næringen, spesielt hvis den skal vokse, må se etter alternative kilder til omega-3-fettsyrene EPA og DHA, som f.eks. alger, gjær eller genmodifiserte planter. Disse kildene vil ofte hovedsakelig inneholde en av disse fettsyrene, og mens behovet for DHA er godt dokumentert, er det usikkert om fisken faktisk har et spesifikt behov for EPA.

Spørsmålet er da om det vil være tilstrekkelig å tilsette DHA fra disse kildene i fôret til laksen, eller om lite EPA i fôret kan få uante konsekvenser i form av redusert motstandsdyktighet mot sykdommer, gjennom å påvirke inflammasjons- og immunresponser.

Prosjektet bygger på en rekke FHF-prosjekter om hvordan fettsyrene i fôret påvirker fiskens helse, og faller inn under i FHFs handlingsplan på temaet “Fiskehelse og fiskevelferd”, og spesielt målsettingen om å “fremskaffe tilstrekkelig dokumentasjon om effekter av endrede fettsyresammensetninger i fôret på fiskens velferd og helse”. I tillegg passer den til dels også inn i målsettingen om å “fremskaffe . . . nye verktøy som kan sikre god fiskevelferd i havbruk” og målsettingen om å “hindre smitte og utbrudd av de mest betydningsfulle infeksjonssykdommene gjennom å fremskaffe god kunnskap”.
Hovedmål
Å avklare betydningen av EPA i fôr for inflammasjons- og immunrespons i laks ved hjelp av cellemodeller.
 
Delmål
1. Beskrive i hvilken grad EPA-nivå i fôr/dyrkingsmedium (når DHA er konstant) påvirker EPA-nivå i cellemembranene i ulike vev som hodenyre, lever, hjerte og fettvev og leukocytt cellelinjer.
2. Avklare hvilken betydning EPA-nivå i membraner til celler isolert fra hodenyre, lever, hjerte og fettvev og leukocyttcellelinjer har på cellenes immunrespons.
3. Sammenligne immunrespons til virusmimikken poly I:C med levende virus; SAV og ILAV.
4. Undersøke om hodenyre- og leverceller i kokultur er et bedre modellsystem i denne sammenhengen enn hodenyreceller alene.
5. Undersøke om cardiomyocytter (hjerteceller) og adipocytteri-kultur kan brukes som modell for infeksjoner som rammer hjertet (f.eks. CMS og HSMB) og muskelens fettvev (f.eks. PD og HSMB).
6. Undersøke om etablerte cellelinjer fra leukocytter kan være like egnede modellsystem som de mer arbeidskrevende primærcellene.
Prosjektet vil gi nødvendig kunnskap for å benytte seg av fremtidens alternative kilder til EPA og DHA, samtidig som man ivaretar fiskens helse og robusthet. Økt kunnskap på dette området vil kunne bidra til økt fleksibilitet i valg av fôrråvarer og/eller redusert tap av fisk i sjøvannsfasen.
Smitteforsøk er svært kostbare, og laks i sjø utsettes for et høyt antall ulike patogener, samtidig som det er usikkerhet rundt hvilke nivå av EPA som vil gi effekter. Derfor benytter dette prosjektet ulike cellemodeller for å studere sammenhengen mellom fettsyren EPA og immun- og inflammasjonsresponser. Lipopolysaccharide (LPS) og polyinosinic acid: polycytidylic acid (poly I:C) gir spesifikke inflammasjonsresponser i fiskens immunceller, og er velkjente og etablerte modeller for henholdsvis bakteriell- og virusinfeksjon.  Disse vil benyttes i dette prosjektet, i tillegg til faktiske patogener som gir store utfordringer i laksenæringen: SAV og ILAV.
 
Arbeidspakkene (AP-ene) i prosjektet er som følger:
AP1: Smoltifisert laks fôres med 5 ulike nivåer av EPA (DHA holdes konstant), fra fisken er ca 70–400 g (Skretting ARC).
 
1.1: Fra denne fisken isoleres hodenyre- og leverceller (primærkulturer) som både alene og sammen i kokultur, eksponeres for LPS, poly I:C og SAV3 (Havforskningsinstituttet).
 
1.2: Fra denne fisken isoleres også hjerteceller (cardiomyocytter) som eksponeres for LPS og poly I:C (Nofima).
 
AP2: Fettceller dyrket i medium med tre økende nivåer av EPA eksponeres for LPS og poly I:C (Nofima).
 
AP3: Leukocytt cellelinjer fra hodenyre (SHK-1 og ASK) dyrkes i medium med økende nivåer av EPA, og eksponeres for LPS, poly I:C og ILAV (Universitetet i Oslo).
 
Prosjektorganisering
Prosjektgruppen består av Skretting ARC, Havforskningsinstituttet, Nofima og Universitetet i Oslo, der hovedansvar for de ulike aktivitetene er angitt i arbeidspakkene over. Prosjektgruppen har solid erfaring både med lipidforskning og bruk av cellemodeller, og har nødvendig kompetanse og fasiliteter for gjennomføring av aktivitetene i dette prosjektet.
Resultater formidles etter hvert som de foreligger i forbindelse med FHF dialogmøter (1–2 ganger per år) innenfor tematikken “Fett for fiskehelse”. Resultater vil også bli presentert ved relevante møter og konferanser, på samarbeidspartnernes nettsider, i form av populærvitenskapelig publikasjon og vitenskapelige publikasjoner i relevante tidsskrifter. Sluttrapporten vil publiseres på FHFs nettsider.
keyboard_arrow_up