Til innholdet

Prosjektnummer

901505

Prosjektinformasjon

Prosjektnummer: 901505
Status: Avsluttet
Startdato: 01.08.2018
Sluttdato: 31.08.2022

Yersiniose: Utredning av økende forekomst hos norsk oppdrettslaks i sjøfasen

​• Det ble påvist kraftig økt utskillelse av Y. ruckeri fra latent infiserte laksepopulasjoner under termisk avlusing både i felt og under kontrollerte laboratorieforsøk. Videre ble det påvist betydelig økning i antall bakterier i behandlingsvannet utover i behandlingsperioden.
• Oppkonsentrering av bakterien i behandlingskamre på avlusere, kombinert med økt stress og direkte fysiske skader påført fisken i forbindelse med behandlingen, representerer sannsynligvis betydelige bidragsfaktorer til utvikling av klinisk yersiniose i etterkant av avlusning. Disse funnene kan også ha implikasjoner for utvikling av andre bakterielle og virale sykdommer.
• Dette viser viktigheten av god oversikt over smittestatus på anlegget, god hygiene, og hyppig vannutskifting i avluseren. Det viser også at avlusning bør gjennomføres med hensyn til smittesituasjon i anlegget, dvs. behandling bør begynne med de “friskeste” merdene, mens fiskepopulasjoner ansett for å ha verre” smittestatus tas til slutt.
• I laboratorieforsøk ble det påvist at latent infisert fisk skiller ut Y. ruckeri bare sporadisk til miljøet under ikke-stressende forhold, noe som er viktig med hensyn på smittesikring, men som også vanskeligjør eDNA-basert påvisning av subklinisk infeksjoner under slike normale driftsforhold.
• Det har blitt utført flere smitteforsøk, og en kohabitant smittemodell for yersiniose i norsk laks er etablert. Latent (subklinisk) Y. ruckeri-infeksjon har blitt dokumentert i overlevende kohabitant-fisk. Det er også utført et forsøk som skulle undersøke om eksponering av laks for miljøisolatene av Y. ruckeri serotype O1 ga beskyttelse mot påfølgende smitte med virulent Y. ruckeri CC1. Eventuell beskyttelse kunne her dessverre ikke bekreftes pga. uforventet lav dødelighet i ett positivt kontrollkar, men fisken som ble immunisert med miljøstammene viste produksjon av antistoffer med betydelig kryss-reaksjon mot Y. ruckeri CC1, noe som betyr at dette området bør forskes videre på.
Sammendrag av resultater fra prosjektets faglige sluttrapport (English summary further below)
Bakgrunnen for prosjektet var det betydelige antall utbrudd av yersiniose blant stor laks, hovedsakelig i Midt-Norge, lang tid etter sjøsetting (ofte andre år i sjøen). Dette var på tidspunktet for etablering av prosjektet et forholdsvis nytt fenomen som eskalerte fra ca. 2015 og økte i omfang fram til man så effekt av stikkvaksinering mot yersiniose, som ble introdusert og tatt i utbredt bruk fra ca. 2016–17. Før ca. 2015 var utbrudd av yersiniose vanligvis begrenset til ferskvannsfasen og kort tid etter sjøsetting. Utbrudd forekommer fortsatt i dag (2022) hos stor fisk i sjø men i mindre omfang og stort sett i uvaksinert fisk. Prosjektet ble igangsatt for å undersøke årsaken(e) til yersiniose-tilfellene lang tid etter sjøsetting.

Hovedresultater fra prosjektet
Det ble påvist kraftig økt utskillelse av Y. ruckeri fra latent infiserte laksepopulasjoner under termisk avlusing både i felt og under kontrollerte laboratorieforsøk. Videre ble det påvist betydelig økning i antall bakterier i behandlingsvannet utover behandlingsperioden. Det ble også påvist i laboratorieforsøk at latent infisert fisk skiller ut Y. ruckeri bare sporadisk til miljøet under ikke stressende forhold, noe som vil vanskeligjør eDNA-basert påvisning av subklinisk infeksjoner under slike “normale” drifts forhold.
• Oppkonsentrering av bakterien i behandlingskamre på avlusere, kombinert med økte stress og direkte fysiske skader påført fisken i forbindelse med behandlingen, representerer sannsynligvis betydelige bidragsfaktorer til utvikling av klinisk yersiniose i etterkant av avlusning. Disse funnene kan også ha implikasjoner for utvikling av andre bakterielle og virale sykdommer. Videre viser dette viktigheten av god oversikt over smittestatus på anlegget, god hygiene, og hyppig vannutskifting i avluseren. Det viser også at avlusning bør gjennomføres med hensyn til smittesituasjon i anlegget, dvs. behandling bør begynne med de friskeste” merdene, mens fiskepopulasjoner ansett for å ha verre” smittestatus tas til slutt.
• Spesifikke PCR-analyser utviklet mot henholdsvis Y. ruckeri på artsnivå og CC1 (norsk laksepatogenvariant), brukt i forbindelse med eDNA-basert kartlegging av virulent og antatt ikke-virulent Y. ruckeri, viser at settefiskanlegg kan være samtidig kolonisert av både virulent og ikke-virulent Y. ruckeri. Det viser seg også at vaksinering mot yersiniose kan resultere i falsk positive PCR-resultater fra miljøprøver i minst 3 uker etter av vaksinering.
• Molekylærbiologiske analyser viser at virulent CC1 fram til ca. midten av 90-tallet bare var en av flere Y. ruckeri genotyper forbundet med fiskesykdom i norsk akvakultur, før den etterhvert begynte å dominere fullstendig. Etter dette kan det se ut som at et slags hovedreservoar for CC1 hele tiden har ligget i Midt-Norge, med flere tilfeller av smittespredning både fra og til denne regionen.
I samarbeid med Norges forskningsråds nærings-PhD prosjekt 297312 har WGS-basert (WGS = helgenomsekvensering) kartlegging og screening av virulensgener blitt brukt til å kartlegge tilstedeværelse av anerkjente virulensgener i en stor samling Y. ruckeri fra hele verden, isolert både fra miljø og syk fisk, og deretter knytte dette opp mot vertsspesifisitet og virulensstatus. Den ikke-virulente statusen til utvalgte norske miljøisolater ble bekreftet gjennom smitteforsøk. Screeningen påviste en variabel korrelasjon mellom virulens og tilstedeværelse av de fleste anerkjente virulensgener, men for et spesifikt invasin-gen, ble en absolutt korrelasjon påvist, dvs. dette genet finnes i alle kjente virulente stammer men ikke i noen miljøstammer.
• Videre er det generelt påvist flere kopier av det tidligere nevnte spesifikke invasin-genet i CC1-isolater fra senere år sammenlignet med eldre isolater fra 1980/1990-tallet. Betydning av dette funnet krever fortsatt videre forskning, men det er mulig at dette kan relateres til 1) dominans av Y. ruckeri CC1 genotypen blant yersiniose-tilfeller i senere år, 2) den forverrede yersiniose-situasjonen generelt i senere år, og/eller 3) den varierende kliniske manifestasjonen av yersiniose hos laks i sjø (tidlig versus sent i sjøfasen).
• Prosjektet har utført flere smitteforsøk, og en kohabitant smittemodell for yersiniose i norsk laks er etablert. Latent (subklinisk) Y. ruckeri-infeksjon har blitt dokumentert i overlevende kohabitant-fisk. Det er også utført et forsøk som skulle undersøke om eksponering av laks for miljøisolatene av Y. ruckeri serotype O1 ga beskyttelse mot påfølgende smitte med virulent Y. ruckeri CC1. Eventuell beskyttelse kunne her dessverre ikke bekreftes pga. uforventet lav dødelighet i ett positivt kontrollkar, men fisken som ble immunisert med miljøstammene viste produksjon av antistoffer med betydelig kryss-reaksjon mot Y. ruckeri CC1, noe som betyr at dette området bør forskes videre på.
• I samarbeid med Norges forskningsråds nærings-PhD prosjekt 297312 har biotype 2 (BT2)-fenomenet blitt karakterisert hos norske laksepatogene Y. ruckeri. BT2 utvikling (dvs. fremvekst av ikke-bevegelige stammer uten flagell) hos regnbueørret-spesifikke stammer har blitt assosiert med vaksinesvikt og BT2 er nå dominerende blant regnbueørret-spesifikke stammer på verdensbasis. Man har identifisert to separate tilfeller av BT2 utvikling hos norske Y. ruckeri, men det ser ikke ut til at denne typen mutant til nå har lyktes i å etablere seg i Norge, muligens pga. at utviklingen virker å ha oppstått hos fisk i sjøvann, noe som trolig representerer en evolusjonær “blindvei” for bakterien i laksen som blir slaktet ut og ikke returnerer til ferskvann.

Konklusjon er at resultatene generert i løpet av prosjektet gir oss en betydelig forbedret forståelse av hvordan og hvorfor yersiniose har blitt en såpass viktig sykdom i norsk akvakultur i de senere år. Resultatene er forenlig med (men beviser ikke) hypotesen om at utbrudd i sjø kan kobles til stress-relatert aktivering av latent (skjult) Y. ruckeri-infeksjon med opprinnelse fra ferskvannsfasen. De molekylære analysene tyder på at Y. ruckeri CC1, som tidligere bare var en av flere sykdomsassosierte stammer på 1980/1990-tallet, har blitt stadig mer utbredt og dominerende i de senere år. Dette kan sannsynligvis relateres til transport av smittet fisk fra region til region samt amplifisering av et spesifikt invasin-gen. Antall kopier av dette genet ser også ut til å korrelere i noe grad med hvordan yersiniose-utbrudd i sjø utspiller seg (om de kommer tidlig eller sent i sjøfasen).

Results achieved
Summary of results from the project's final report
The project was initiated against a background of increasing numbers of yersiniosis outbreaks in populations of large sea-farmed salmon, late in the sea-phase of culture, mostly in mid-Norway. At the start of the project period this was a fairly new phenomenon that was first observed ~2015, but which increased in prevalence until effectively mitigated by widespread use of intraperitoneal vaccination ~2016/2017. Prior to 2015, outbreaks of yersiniosis were largely confined to the freshwater phase of culture and a short period after sea-transfer. Outbreaks amongst large sea-farmed fish continue to occur post introduction of intraperitoneal vaccination, but to a much lesser degree, and now involve for the most part unvaccinated fish. The current project was therefore initiated to investigate the cause/s of these outbreaks late in the sea-phase of culture.

Main results generated during the project
•Significant shedding of Y. ruckeri was identified from latently infected salmon during thermal delousing under field conditions and during controlled, simulated thermal delousing in the laboratory. Further, the number of bacteria in the treatment water increased with the number of fish treated. It was established in laboratory trials that latently infected fish shed Y. ruckeri only intermittently under non-stressful conditions, a fact that will make eDNA based screening for the bacterium challenging during normal production. Increasing numbers of bacteria within the delousing treatment chamber combined with increased stress and direct physical injury to the treated fish, likely represent a major contribution towards the recent spate of yersiniosis outbreaks reported following non-medicinal delousing. These findings may also have implications for development of other diseases of both viral and bacterial aetiology, while further highlighting the importance of knowing the infection status in the farm, good general hygiene and regular replacement of treatment water in the delouser. It also demonstrates that delousing should be performed with consideration of the infection status in individual cages, beginning with the ‘healthiest’ cages and working steadily towards populations of fish considered to have poorer health.
• Specific PCR analyses developed for detection of Y. ruckeri at the species, CC1 (Norwegian pathogen) and CC2 (international rainbow trout pathogen) levels respectively, revealed that production farms for juvenile salmon may be colonised by both virulent and avirulent Y. ruckeri and that vaccination against yersiniosis may result in false positive PCR results at least 3 weeks after vaccination.
• Molecular biological analyses reveal that prior to ca. the mid-90s, CC1 was only one of several Y. ruckeri genotypes associated with fish disease in Norwegian aquaculture, but that this genotype subsequently became almost completely dominating. It appears that mid-Norway has remained the main geographical reservoir for CC1 with several independent transmissions to and from this area being identified. The analyses show that the isolates found in the outermost (newest) tip in the CC1 phylogenetic tree all originate, without exception, from sea-farmed salmon in Mid- and Western-Norway post-2016.
• In cooperation with NRC Industry-PhD project 297312, WGS-based mapping of virulence genes has shown that fish pathogenic strains of Y. ruckeri share specific genomic areas that are not found in putatively avirulent strains. The mapping identified a variable correlation between virulence and many recognised virulence genes, but for one specific invasin gene, an absolute correlation was identified, i.e. it is found in all virulent strains but is not found in any avirulent strain.
• Further, the project identified more copies of the previously mentioned specific invasin gene in CC1 strains isolated in later years compared to strains isolated during the 1980/1990’s. The importance of this finding needs further research but it is possible that this gene ‘amplification’ is related to 1) the dominance of Y. ruckeri CC1 genotype in recent years 2) the escalation of yersiniosis in Norwegian aquaculture in recent years and/or 3) clinical manifestation of the disease at sea.
• Several infection trials have been performed and a cohabitant infection model for Atlantic salmon in freshwater has been established. Latent infections have also been documented in surviving cohabitant fish. A trial has also been conducted which aimed at investigating whether exposure to avirulent, environmental strains of Y. ruckeri awarded protection against subsequent challenge with virulent Y. ruckeri CC1. A significant degree of protection could unfortunately not be confirmed due to unexpected low mortality in one of the positive control groups, but fish inoculated with environmental strains displayed significant antibody production against Y. ruckeri CC1, indicating that this phenomenon should be further studied.
• In cooperation with NRC Industry-PhD project 297312, the biotype 2 (BT2) phenomenon, i.e. development of non-motile, non-flagellated strains, has been studied genetically in Norwegian CC1 BT2 isolates. It does not appear that this type of mutation has successfully become established in Norwegian aquaculture, possibly due to the fact that these strains appear to have developed in sea-farmed fish, which represent an evolutionary dead-end for the bacteria as the infected fish are harvested and do not return to freshwater.

In conclusion, the results generated in the course of the project provide a considerably improved understanding of how and why yersiniosis has become such an important disease in Norwegian aquaculture in recent years. The results are consistent with (but do not prove) the hypothesis that outbreaks in the marine environment are related to stress-related activation of latent Y. ruckeri infections originating from the freshwater phase of culture. Molecular biological studies indicate that Y. ruckeri CC1 was originally one of several genotypes associated with yersiniosis in Norway in the 1980/1990’s, but that it subsequently extended its range and became increasingly (almost totally) dominating. This was probably related to transport of infected fish from region to region in addition to the amplification of a specific invasin gene in CC1. To some extent, the copy number of this gene further appears related to how yersiniosis outbreaks at sea manifest (i.e. whether they occur early or late in the sea phase).
​Prosjektet har fremskaffet ny kunnskap og nye verktøy for denne bakterielle sykdommen i norsk laksenæring. Man har dokumentert utbredelse og prevalens i norske sjøanlegg, avdekket risikofaktorer og årsakssammenhenger bak dødelighet/kliniske utbrudd, beskrevet beskyttende immun-mekanismer samt etablert nytt PCR-diagnostisk verktøy og en kontrollert smittemodell for sykdommen. Dette er sentral kunnskap og viktige verktøy som vil kunne benyttes for iverksetting av tiltak for forebyggende sykdomsovervåkning og kontroll med yersiniose.
Yersiniose forårsakes av bakterien Yersinia ruckeri, og er i Norge forbundet nesten utelukkende med sykdom hos laks. Yersiniose er i utgangspunktet å regne som en ferskvannssykdom, men de siste 2-3 årene har det vært en betydelig økning i antall påviste utbrudd hos laks i sjø, særlig i Midt-Norge. For en stor andel av tilfellene sees ingen direkte sammenheng med kjent Y. ruckeri-​problematikk i ferskvannsfasen.

Forsøk med intraperitonal vaksinering har gitt lovende resultater, men økt kunnskap om bakterien, smitteveier og smittedynamikk på lengre sikt kan gjøre vaksinering mot Y. ruckeri unødvendig. Prosjektet skal derfor fokusere på identifisering av årsaken(e) bak økningen i antall utbrudd av yersiniose i Midt-Norge.

Hovedmål
Å generere kunnskap rundt yersiniose-situasjonen hos oppdrettslaks i sjø i Midt-Norge, slik at sykdommen effektivt kan bekjempes og kontrolleres på best mulig måte.​
 
Delmål
• Å identifisere årsaksforhold i forbindelse med yersiniose hos sjøsatt laks, særlig sent i sjøfasen.
• Å utvikle verktøy for sensitiv og spesifikk påvisning av Y. ruckeri serotype O1, klonalkompleks 1.
• Å identifisere prevalensen av Y. ruckeri generelt, og Y. ruckeri serotype O1 klonalkompleks 1 spesielt, i settefisk- og matfiskanlegg i Midt-Norge.
• Å foreta en molekylærepidemiologisk studie av yersiniose i Midt-Norge basert på MLVA (Multi-Lokus VNTR Analyse) og helgenom-sekvensering.
• ​Å utvikle Y. ruckeri-smittemodeller for laks i ferskvann og sjøvann for testing av faktorer som kan utløse sykdom.

På kort sikt vil vi øke vår forståelse av mekanismene bak yersiniose-situasjonen i sjøen i Midt-Norge. Identifikasjon av årsaksforhold vil forhåpentligvis på lengre sikt gjøre stikk-vaksinering mot Y. ruckeri unødvendig. Gjennom identifisering av smitteveier bør det være mulige å introdusere målrettede tiltak som vil begrense betydningen av yersiniose i norsk lakseoppdrett. Totalt vil dette bedre fiskevelferden samt redusere kostnader (vaksinering, behandling osv.) og øke lønnsomheten i næringen. Ressursbruk i prosjektet vurderes som ubetydelig sett i forhold til de totale kostnadene forbundet med håndtering av yersiniose-utbrudd i Norge.

Prosjektet er delt inn i fem arbeidspakker:

AP 1: Utvidede diagnostiske undersøkelser av Yersinia ruckeri-assosiert dødelighet i sjø i Midt-Norge
Ledes av Jinni Gu, Veterinærinstituttet Trondheim.
Arbeidspakken har som mål å undersøke årsaksforhold knyttet til yersiniose på sjøsatt laks, og særlig sent i sjøfasen, ved utvidete diagnostiske undersøkelser. Dette vil kunne vise om Y. ruckeri-infeksjon alene kan forklare den observerte sykdommen/dødeligheten, eller om bakterien kun representerer en av flere agens som aktiveres i forbindelse med eksterne triggere som f.eks. stress. 

AP 2: Utvikling av en qPCR for spesifikk deteksjon av Y. ruckeri klonalkompleks 1
Ledes av Duncan J. Colquhoun, Veterinærinstituttet Oslo.
Arbeidspakken har som mål å utvikle et sensitivt og spesifikt qPCR-assay som et nødvendig deteksjonsverktøy for påvisning av Y. ruckeri serotype O1, klonalkompleks 1. Dette assayet vil benyttes i arbeidspakke 1, 3 og 5.

AP 3: Screening av mulige smittekilder og påvisning av sub-kliniske Y. ruckeri klonal kompleks 1-infeksjoner
Ledes av Duncan J. Colquhoun, Veterinærinstituttet Oslo (VIO), i samarbeid med Heidrun Wergeland, Universitet i Bergen (UiB), og Magnus Devold, Patogen AS.
Arbeidspakken har som mål å identifisere mulige smittekilder og påvisning av sub-kliniske infeksjoner i settefisk og matfiskanlegg i Midt-Norge, hvor det har vært flest tilfeller av yersinioseutbrudd de senere årene. 

AP 3a (VIO, UiB): Det vil utvikles og valideres metodikk for rensing og bearbeidelse av miljø-DNA (eDNA) for spesifikk påvisning av bakterien i prøver fra sjøvann og ferskvann. 

AP 3b (VIO, Patogen): Ved innsamling av biofilm og eDNA prøver fra settefiskanlegg som leverer smolt til affiserte sjøområder, vil man gjennom qPCR-analyser kartlegge prevalensen av Y. ruckeri generelt og klonalkompleks 1 spesielt, og mulig senere assosiasjon med utbrudd av yersiniose i sjøanlegg.

AP 4: Molekylærepidemiologi
Ledes av Snorre Gulla, Veterinærinstituttet Oslo, i samarbeid med Ed Feil og Sion Bayliss, University of Bath (UK).
Arbeidspakken har som mål å utføre et molekylærepidemiologisk studium av yersiniose i Midt-Norge basert på MLVA (Multi-Lokus VNTR-Analyse) genotyping og helgenom-sekvensering av arkiverte stammer og isolater dyrket fra settefisk- og matfiskanlegg i Midt-Norge, både før og under prosjektperioden. 

AP 5: Utvikling av smittemodeller for Y. ruckeri-infeksjoner i ferskvann og sjøvann, persistensstudier og undersøkelser av organtropisme i persistente/latente infeksjoner
Ledes av Heidrun Wergeland fra oppstart og fra september 2019 av Anita Rønneseth, begge ved Universitet i Bergen, i samarbeid med Jinni Gu og Duncan Colquhoun, Veterinærinstituttet, og Magnus Devold, Patogen AS.
Arbeidspakken har som mål å utvikle Y. ruckeri smittemodeller for laks i ferskvann og sjøvann for å besvare følgende spørsmål:
1) Hvor effektivt smitter bakterien horisontalt mellom laks i sjøvann?
2) Er stammer av serotype O1 som ikke tilhører klonalkompleks 1 mindre virulente eller arviulente overfor laks?
3) Er laks som går i system kolonisert av presumptivt avirulent serotype O1 beskyttet eller mindre mottakelige for utbrudd forårsaket av virulent serotype O1 (klonalkompleks 1)?
4) Hvor finnes bakterien i fisken?
5) Kan stressbegivenheter som for eksempel varmtvannsbehandling/spyling “trigge”​/utløse utbrudd av yersiniose i latent infisert laks? 
Prosjektgruppen vil formidle resultater fortløpende gjennom presentasjoner på møter og konferanser både nasjonalt (FHF-møter, Frisk Fisk, Havbruk o.l.) og internasjonalt (konferanser i regi av European Association of fish Pathologists​ (EAFP) og International Symposium on Aquatic Animal Health​ (​ISAAH)). Prosjektgruppen vil prioritere både populærvitenskapelig og vitenskapelig publisering, og forutser minst en populærvitenskapelig og en vitenskapelige publikasjon per arbeidspakke (eksakte titler og leveringsdatoer fastsettes senere).
keyboard_arrow_up