Til innholdet

Prosjektnummer

901588

Prosjektinformasjon

Prosjektnummer: 901588
Status: Avsluttet
Startdato: 01.11.2019
Sluttdato: 29.03.2024

Nefrokalsinose og hemoragisk smoltsyndrom: Årsakssammenhenger og muligheter for forebygging (STONEHUNT)

Ny kunnskap om årsaker til nefrokalsinose (NK) og hemoragisk smoltsyndrom (HSS) for iverksetting av tiltak for forebygging og reduksjon av utbredning av sykdommene
• I en kartlegging av nefrokalsinose (NK) og hemoragisk smoltsyndrom (HSS) i seks kommersielle settefiskanlegg fra oktober 2019 til august 2021 ble begge sykdommene påvist i alle anleggene. Histologisk undersøkelse viste en prevalens av NK på 35,8 %, med variasjon mellom anlegg fra 8,3 til 64,3 %. For HSS var prevalens 10,7 %, med variasjon fra 1,4 til 22,5 %.
• Både NK og HSS hadde høyest prevalens og alvorlighetsgrad på siste uttak før sjøsetting, med gjennomsnittlig 60,7 % prevalens av NK og 25,2 % prevalens av HSS.
• NK og HSS framsto som to ulike sykdomstilstander som til en viss grad forekom parallelt, og som kan ha delvis overlappende årsaksfaktorer. Det ble ikke funnet bevis for at HSS er en forløper for utvikling av mineralutfellinger og NK.
• I kontrollerte forsøk med laks under smoltifisering ble det funnet en klar sammenheng mellom eksponering for høye nivåer av CO2 og utvikling av NK. Ved eksponering for CO2 på 16 mg/L (9 ⁰C, 1–7 promille salt) ble det påvist moderate fysiologiske endringer i fisken, men ikke påvist NK. Eksponering for 23 mg/L (5 ⁰C, 0 promille salt) i forsøk 2 ga derimot en rask utvikling av NK.
• I forsøk 1 ble det det påvist NK hos parr som ble tatt inn til forsøket fra flere kommersielle settefiskanlegg. Hos forsøksfisken ble forekomsten av NK raskt redusert, mens i samme fiskegruppe som sto igjen i settefiskanleggene ble det påvist en markert øking av NK i tiden fram til sjøsetting. I forsøk 2 hadde fisken 25 % prevalens av NK før inntak og akklimatisering i laboratoriet, og 16,5 % ved start av forsøket. I fisken som ble eksponert for høy CO2 steg prevalensen av NK raskt, mens NK var forsvunnet i kontrollfisken etter 37 dager. Forekomsten av NK ble raskt redusert etter overføring til ferskvann eller til sjøvann med lave nivå av CO2.
• I forsøk 2 var det økt akkumulering av kalsium i nyre og indikasjon på økt mineralisering av ryggvirvlene hos fisk eksponert for CO2 sammenlignet med kontrollfisken. Det ble også påvist økt ratio av Ca/P i nyrevevet med økende grad av NK.
• I grupper som ble eksponert for CO2 (både 16 og 23 mg/L) var det økt PCO2 i blod, økt nivå av plasma HCO3-, økt plasma pH og redusert nivå av plasma klorid.
• Bruk av bedøvelse ved blodprøvetaking kan ha stor innflytelse på plasmaverdier og bør tas i betraktning ved planlegging, gjennomføring og tolking av resultater.
• I forsøk 2 ble HSS påvist i alle forsøksgruppene, men med et markert utbrudd i ett av karene der fisken ble eksponert for 23 mg/L CO2 og 123 % DO (oppløst oksygen).
• Fisk med HSS hadde lavere hematokrit enn fisk uten påvist HSS, dette gjaldt både i forsøk og i feltundersøkelsen.
• Fisk med HSS hadde signifikant høyere vekt enn fisk uten påvist HSS i samme gruppe, dette gjaldt både i forsøk og i feltundersøkelsen. Variasjoner i smoltifiseringsprosessen (hormonstatus og aktivitet av gjelle ATP-ase) så ut til å være assosiert med utviklingen av HSS. HSS økte i ferskvannsperioden og stoppet ved overgangen til sjøvann.
• Årsaken til utvikling av HSS er fortsatt uavklart. I prosjektet ble det ikke påvist noen infeksiøs årsak.
Sammendrag av resultater fra prosjektets faglige sluttrapport (English summary further below)
Sykdommene nefrokalsinose (NK) og hemoragisk smoltsyndrom (HSS) er vurdert som to av de viktigste helseutfordringene ved produksjon av settefisk (atlantisk laks). Nefrokalsinose blir påvist både hos laks og regnbueørret. NK karakteriseres av mineralholdige utfellinger i nyrets ekskresjonssystem, der urinen dannes. Utførselsgangene blir skadet og tilstoppet og etter hvert blir også interstitielt bloddannende vev i nyret påvirket. HSS rammer laks gjerne i rent ferskvann før og under smoltifisering og påvises i tidlig fase som blødninger til nyretubuli, men etter hvert oppstår omfattende blødninger i muskulatur og indre organer. 

For NK er det i en rekke forsøk vist at fysiologiske endringer i fisken og mineralutfellinger kan oppstå som følge av forhøyede verdier av CO2 i vannet, med en antatt grenseverdi for utvikling av nyreskader rundt 15 mg/L. Betydningen av andre forhold, som tidligere livshistorie, vanntemperatur, salinitet og andre vannkvalitetsparametere har vært mer usikker. For HSS har man ikke hatt noen sikre hypoteser om årsaksforhold, utover at det ikke ser ut til å skyldes et smittsomt agens. Nefrokalsinose og HSS kan oppstå samtidig og begge tilstandene kan føre til økt dødelighet, men som regel med rask helbredelse etter at fisken kommer ut i sjøvann. Det har vært spekulert i at HSS med blødning til tubuli kan utgjøre en risikofaktor for utfelling av mineralsteiner og dermed være en forløper til NK. 

I dette prosjektet ble det kartlagt forekomst av NK og HSS i seks kommersielle settefiskanlegg, og samtidig gjennomført måling av blodverdier og undersøkelse av vannkvaliteten i anleggene. I to laboratorieforsøk ble laks eksponert for økt nivå av CO2 i tida under smoltifisering og fisken ble fulgt i ca. 50 dager etter overføring til sjøvann. Frem til oppstart av forsøket ble fisken holdt ved lysregime LD 12:12 (vintersignal), før det ble justert til fullt lys (LD 24:0) ved oppstart. I forsøk 1 ble det undersøkt effekten av moderat CO2-belastning (16 mg/L) i ferskvann med 9 ⁰C og salinitet fra 1 til 7 promille. Settefisk fra tre kommersielle anlegg ble brukt sammen med fisk fra forsøksstasjonen på Matre for å undersøke om tidligere livshistorie kunne ha innflytelse på fiskens respons på CO2-belastningen. I forsøk 2 ble det brukt ferskvann med en temperatur på 5 ⁰C. Her ble CO2-nivået økt til 23 mg/L, og det var i tillegg en testgruppe der CO2-belastning ble kombinert med en moderat hyperoksi (125 % DO). I begge forsøk var det kontrollgrupper som ble eksponert for lav CO2 (2–3 mg/L). 

Fysiologiske og histopatologiske funn var i overenstemmelse med tidligere beskrivelser av NK og HSS, og det var et godt samsvar mellom funn i forsøkene og det som ble påvist i prøvematerialet fra kommersielle settefiskanlegg. I prøver fra settefiskanlegg var prevalens av NK på 35,8 % og prevalens av HSS på 10,7 %, mens vannkvalitetsmålinger stort sett viste moderat belastning og verdier av CO2 under 15 mg/L. I de kontrollerte forsøkene ble forekomst av fisk med NK tydelig redusert etter at fisken ble flyttet til kar med lav belastning av CO2. Det samme skjedde med både HSS og NK etter overføring til sjøvann, og det skjedde både i forsøk og i de kommersielle anleggene. I forsøk og feltmateriale fant prosjektgruppen mange fisk som hadde HSS og NK samtidig, men i tidsserier fra ulike kar eller anlegg ble NK i hovedsak påvist tidligere enn HSS. HSS så ikke ut til å være en forløper for NK. Det så ut til at tilstandene forekom parallelt, og at de til en viss grad kunne utløses av de samme miljøbelastningene. NK og HSS så ut til å gi ulike fysiologiske endringer i fisken og bør anses som to ulike sykdomstilstander. Bruk av smoltprotokoll med lysstyring kan se ut til å påvirke forekomsten av NK. 

I begge forsøkene førte belastning med CO2 under smoltifiseringen til fysiologiske endringer i smolten. Økt nivå av CO2 i plasma førte umiddelbart til redusert pH i blodet. Dette ble kompensert ved at fisken tok opp HCO3- fra vannet i bytte med Cl-, pH i blodet steg, mens plasma Cl- gikk ned. Ved moderat CO2-belastning i forsøk 1 (16 mg/L) ble det ikke påvist utvikling av verken NK eller HSS, og det var små og forbigående utslag på hematokrit og plasmaverdier som Na+, K+, Ca2+, selv om det så ut til å være tydelige forskjeller i fysiologisk respons mellom de ulike fiskegruppene. Ved høy CO2-belastning i forsøk 2 (23 mg/L) ble det funnet en tydelig økning i forekomst av NK og i et av replikatene med kombinert CO2- og O2-belastning var det en markert økning i forekomst av HSS, også med dødelighet. Her registrerte man en tydelig sammenheng mellom NK og økt plasma Ca2+, en effekt som så ut til å bli påvirket av avlivingsmetoden. Fisk med økende grad av NK hadde økt Ca/P-ratio i nyrevevet, et forhold som ikke ble påvirket av avlivingsmetoden. Hos fisk som ble eksponert for CO2-verdier på 23 mg/L var det også redusert tilvekst, akkumulering av kalsium i nyre og indikasjoner på økt mineralisering av ryggvirvler.

Results achieved 
Summary of results from the project's final report
The diseases nephrocalcinosis (NC) and hemorrhagic smolt syndrome (HSS) are ranked as two of the most significant health challenges in the production of fry (Atlantic salmon). Nephrocalcinosis is detected in both salmon and rainbow trout and is characterized by mineral deposits in the kidney's excretory system, where urine is formed. The ducts become damaged and blocked, eventually affecting the interstitial blood-forming tissue in the kidney. HSS typically affects salmon in freshwater before and during smoltification, it is detected in the early phase as bleeding into the renal tubules, but extensive bleeding in muscles and internal organs occurs over time. For NC, several studies have shown physiological changes in fish and mineral deposits due to elevated levels of CO2 in the water, with an estimated threshold value for the development of kidney damage around 15 mg/L. The significance of other factors, such as early life history, water temperature, salinity, and other water quality parameters, has been more uncertain. For HSS, there has not been identified any probable causes, other than the absence of an infectious ethology. NC and HSS can occur simultaneously, and both conditions can lead to increased mortality, usually with rapid recovery after sea transfer. It has been hypothesized that HSS with bleeding into tubules may be a risk factor for the precipitation of mineral stones and thus be a precursor to NC. 

In this project, the prevalence of NC and HSS was surveyed in six commercial fry facilities, and simultaneous measurements of blood values and examination of water quality were conducted in the facilities. In two laboratory experiments, salmon parr were exposed to increased levels of CO2 during smoltification, and the fish were monitored for about 50 days after transfer to seawater. Prior to the experiment, the fish were exposed to a 12:12 photoperiod (winter), adjusting this to full light (24:0) at the onset of the trial. In Experiment 1, the effect of moderate CO2 loading (16 mg/L) in freshwater with a temperature of 9°C and salinity from 1 to 7 ppt (parts per thousand) was examined. Fry from three commercial facilities were used along with fish from the Matre research station to investigate whether early life history could influence the fish's response to CO2 loading. In Experiment 2, freshwater with a temperature of 5°C was used. Here, the CO2 level was increased to 23 mg/L, and there was an additional test group where CO2 loading was combined with moderate hyperoxia (125% DO). In both experiment, comparative control groups exposed to low CO2-levels (2–3 mg/L) where included. 

Physiological and histopathological findings were in line with previous descriptions of NC and HSS, and there was good correlation between the findings in the experiments and those found in the samples from commercial hatcheries. In samples from hatcheries, the prevalence of NC was 35.8%, the prevalence of HSS was 10.7%, while water quality measurements mostly showed moderate loading and CO2 values below 15 mg/L. In controlled experiments, the occurrence of fish with NC was significantly reduced after the fish were moved to tanks with low CO2 loading. The same occurred with both HSS and NC after transfer to seawater, both in experiments and in commercial facilities. In experiments and field materials, the project group found many fish displaying signs of HSS and NC simultaneously, but in time series from different tanks or facilities, NC was mainly detected earlier than HSS. Thus, HSS did not seem to be a precursor to NC. It appeared that the conditions occurred in parallel, to some extent triggered by the same environmental stresses. NC and HSS seemed to cause different physiological changes in the fish and should be considered as two distinct disease conditions. The prevalence of NC is possibly influenced by the use of a photoperiod to induce parr-smolt transformation. 

In both experiments, CO2 exposure during smoltification induced an immediate increase in CO2 levels in plasma with a subsequent reduction of blood pH. This was compensated by uptake of HCO3- from the water in exchange for Cl-, thus blood pH increased and plasma Cl- decreased. With moderate CO2 exposure in Experiment 1 (16 mg/L), there was no development of neither NC nor HSS, and there were small and transient effects on haematocrit and plasma values such as Na+, K+, Ca2+, although there appeared to be clear differences in physiological response between the different fish groups. With high CO2 exposure in Experiment 2 (23 mg/L), a clear increase in the incidence of NC was observed, and in one of the replicates with combined exposure of CO2 and O2, also a marked increase in the incidence of HSS, including mortality. There was a correlation between NC and increased plasma Ca2+, however, the effect seemed to be influenced by the euthanasia method. Fish with an increasing degree of NC showed an increased Ca/P ratio in kidney tissue, a ratio unaffected by the euthanasia method. In fish exposed to CO2 values of 23 mg/L, there was also reduced growth, accumulation of calcium in the kidney and signs of increased mineralization of the vertebra.
​Prosjektet har gitt ny kunnskap om utbredelsen av nefrokalsinose og HSS i norsk settefiskproduksjon av laks samt årsaker knyttet til fiskens vannmiljø som utløser tilstandene. Kunnskapen kan benyttes for iverksetting av tiltak for å forebygge mot og redusere prevalensen av tilstandene i settefiskanlegg, og derved medføre forbedret smoltkvalitet og potensielt bedre prestasjon og høyere overlevelse i sjø. 
  • Sluttrapport: Nefrokalsinose og hemorragisk smoltsyndrom: Årsakssammenhenger og muligheter for forebygging (STONEHUNT)
    Veterinærinstituttet. Rapport 6 - 2024. Mars 2024. Av Arve Nilsen, Sveinung Fivelstad (Høgskulen på Vestlandet), Camilla Diesen Hosfeld (Høgskulen på Vestlandet), Anne Berit Olsen, Kai-Inge Lie (Pharmaq Analytiq AS), Marianne Kraugerud (Pharmaq Analytiq AS), Per Gunnar Fjelldal (Havforskningsinstituttet), Ingunn Sommerset, Ian Mayer (Norges Miljø- og Biovitenskapelige Universitet) og Sofie Charlotte Remø (Havforskningsinstituttet).
  • Vit. artikkel: Nyrestein hos laks
    Artikkel i Norsk Fiskeoppdrett, nr. 3/2024, s. 80–83. Av Arve Nilsen (Veterinærinstituttet), Sveinung Fivelstad (Høgskulen på Vestlandet;), Camilla Diesen Hosfeld (Veterinærinstituttet), Anne Berit Olsen (Veterinærinstituttet), Kai-Inge Lie (Pharmaq Analytiq AS), Marianne Kraugerud (Pharmaq Analytiq AS), Per Gunnar Fjelldal (Havforskningsinstituttet), Ingunn Sommerset (Veterinærinstituttet), Ian Mayer (NMBU – Norges miljø- og biovitenskapelige universitet) og Sofie Charlotte Remø (Havforskningsinstituttet).
  • Vit.artikkel: Stonehunt: Nefrokalsinose og hemoragisk smoltsyndrom – årsakssamanhengar og moglegheiter for førebygging
    Artikkel i Norsk Fiskeoppdrett, nr. 4/2020: 42-45. Av Ingunn Sommerset, Anne Berit Olsen, Arve Nilsen, Mona Gjessing, Marianne Kraugerud, Kai-Inge Lie, Camilla Diesen Hosfeld, Sveinung Fivelstad, Ian Mayer, Finn Arne Weltzien, Sofie Charlotte Remø, Ole Folkedal, Audun Østby Perdesen, Per Gunnar Fjelldal og Rune Waagbø.
​Produksjon av settefisk har blitt mer intensivert de siste årene og flere produsenter har opplevd utfordringer med “gamle problemer” som nefrokalsinose (NK) og hemoragisk smoltsyndrom (HSS). Dette er diagnoser som har vært kjent fra oppdrettslaks i lang tid, men den medisinske og fysiologiske forståelsen av tilstandene er mangelfull. Klassisk NK hos fisk forbindes med vannmiljø og kalsifiserte utfellinger i nyre. HSS er en generell blødningstendens der det lekker plasmaproteiner og blodceller ut i vevet og i urinveiene. Trolig kan disse tilstandene forekomme samtidig, i ulike kombinasjoner og/eller påvirke hverandre. Det er derfor viktig at en får relatert årsaker og effekter presist slik at riktige tiltak kan settes inn. Flere publikasjoner viser en korrelasjon mellom langvarig høye CO2-nivå og utvikling av NK hos laks. Likevel må flere faktorer spille inn da høyt CO2 alene ikke ser ut til å være nok. I studier av årsakssammenhenger og mekanismer er laboratoriemodeller for NK og HSS viktig. Samtidig kan ikke resultater fra kontrollerte forsøk frikobles fra realitetene i felt. Med økt kunnskap om hvilke faktorer eller kombinasjoner av faktorer som leder til NK og HSS og en mer målrettet diagnostikk, kan næringen i større grad unngå eller forebygge utviklingen på et tidlig stadium. 
​Hovedmål
Å karakterisere NK og HSS-tilstandene og definere hvilke kombinasjoner av faktorer i miljø og fiskens biologi som kan knyttes til utvikling av sykdommene.

Delmål
Med utgangspunkt i at langvarig forhøyet CO2 er en kjent risikofaktor – undersøke hvilke tilleggsfaktorer som kan påvirke forekomsten ved:​
• Å kartlegge og analysere miljø og fisk i longitudinelle​ studier i risikoanlegg i felt, og korrelere disse faktorene til forekomst og alvorlighetsgrad av tilstandene. 
• Å teste hypotesen om at det skjer fysiologiske forandringer i nyrene under langvarig eksponering for intensiv drift som fører til at smolten er mer utsatt for å få NK enn smolt under ikke-intensiv drift. 
• Å teste hypotesen at HSS øker sannsynligheten for NK ved at lekkasje av blodceller eller plasmaprotein danner kimen til mineralisering og utfelling i nyretubuli.
• Å karakterisere morfologisk og kategorisere NK og HSS fremprovosert under ulike miljøforhold i kontrollert forsøk versus felt. 
• Å etablere en laboratoriemodell for HSS og rette fokus mot blodet, blodbanene og hormoner, for å se etter en forklaring som setter oss på sporet av mekanismene som utløser HSS.
• Å øke kunnskapen om endringer i nyrefunksjon knyttet til osmoregulering. 
• Å beskrive metabolske og fysiologiske forandringer i fisken med og uten NK og HSS, med fokus på mineralomsetning, oksidativt stress, bufferkapasitet og velferd.
​Prosjektet er viktig for å kunne redusere antall tilfeller og alvorlighetsgraden av NK og HSS, ettersom begge tilstandene gir økende velferds- og tapsproblemer i dagens settefiskproduksjon. Det er overraskende lite forskning som er publisert på de to sykdommene. Med økt kunnskap om hvilke faktorer eller kombinasjoner av faktorer som leder til NK og HSS og en mer målrettet diagnostikk, kan næringen, inkludert leverandører av for eksempel rogn og fôr, i større grad unngå eller forebygge utvikling med målrettede tiltak på et tidlig stadium.
​Prosjektet er inndelt i fire arbeidspakker (AP-er):

AP 1: Risikobasert prøveuttak fra felt – tidsserier
Ansvar: Veterinærinstituttet (VI) og Fish Vet Group (FVG) (som i mars 2021 ble overtatt av PHARMAQ Analytiq AS)
Basert på et utvalg av settefiskanlegg med en kjent historikk (risiko) for NK og/eller HSS, skal det utføres tre prøveuttak før sjøutsett (parr, pre-smolt, smolt), samt at utsatte grupper følges opp i sjø. Primært vil histopatologiske forandringer i nyre brukes for å følge utviklingen av NK og HSS, men det tas også ut en rekke prøver for morfologiske, fysiologiske og biokjemiske analyser som kan bidra til å kartlegge mekanismer og forløp under ulike feltforhold.

AP 2: Eksperimentelle studier
Ansvar: Høgskolen på Vestlandet (HVL) og Havforskningsinstituttet (HI)
Her planlegges to forsøk: Ett forsøk der pre-smolt fra intensive og ikke-intensive anlegg utsettes for høy og lav CO2, og ett forsøk der man forsøker å etablere en laboratoriemodell for HSS. Som for AP1, vil primært histopatologiske forandringer i nyre brukes for å følge utviklingen av NK (og HSS) og det tas ut en rekke prøver for morfologiske, fysiologiske og biokjemiske analyser som kan bidra til å kartlegge mekanismer og forløp under kontrollerte forhold.

AP 3: Analyser av prøver fra AP1 og AP2 
Ansvar: HVL, VI, HI, FVG/PHARMAQ Analytiq AS og Norges miljø- og biovitenskapelige universitet (NMBU)
Her inngår morfologiske analyser med utarbeidelse av et felles scoringssystem for histopatologiske forandringer karakteristisk for NK og HSS. Blodprøver fra sekvensielle uttak vil bli analysert i søken etter markører for NK og HSS (klinisk kjemi) og hormoner knyttet til smoltifisering og kalsiumhomeostase, blodelektrolytter, hematologiske parametere samt markører for oksidativt stress vil bli analysert.

AP 4: Sammenstilling av data og publisering
Ansvar: HVL
Det innhentes store mengder data i AP1–3 som krever systematisk datahåndtering, kvalitetssikring og prosessering for å kunne gjøre statistiske analyser og resultater tilgjengelige i form av populærvitenskapelige artikler og manus til fagfellevurderte artikler.
​Prosjektet vil bli presentert i Norsk Fiskeoppdrett i løpet av våren 2020, og tidlige resultater på Frisk Fisk-konferansen 1. kvartal 2021, samt en oppfølgingsartikkel i Norsk Fiskeoppdrett 3. kvartal 2021. Resultatene skal også presenteres på FHF-seminarer og ferdigstilling av manus til minst en vitenskapelig artikkel i internasjonalt tidsskrift planlegges ved prosjektslutt 4. kvartal 2022.
keyboard_arrow_up