Prosjektnummer
901874
Risikofaktorer i norske settefiskanlegg relatert til utvikling av nefrokalsinose hos atlantisk laks og regnbueørret – Reduksjon og forebyggende tiltak (NephroReduce)
Dagens produksjonsprotkoller i settefiskfasen er i all hovedsak utviklet med tanke på høyere kapasitet, effektivitet og økonomi for å kunne levere smolt til åpne merder året rundt. Dette har ført til økt intensitet og bruk av mange ulike produksjonsprotokoller samtidig som det har vært et raskt skifte i teknologi fra bruk av gjennomstrømningsanlegg (FTS) til resirkuleringsanlegg (RAS).
Nefrokalsinose er en tilstand der utfellinger av salter i nyrene, hovedsakelig kalsium, magnesium og fosfat, har blitt en av de mest vanlige og alvorlige produksjonslidelsene i norske settefiskanlegg. Flere hypoteser om underliggende årsaker har blitt fremsatt, blant annet bruk av salinitet i produksjonsvann, høye nivå av karbondioksid (CO2) og oksygen (O2), høye nivå av selenium og/eller lave nivåer av magnesium i fôret. Likefullt, i 2022 var nefrokalsinose rangert som den nest største årsaken til dødelighet, redusert velferd og vekst i norske settefiskanlegg, og var den lidelsen som økte mest i 2022, både for atlantisk laks og regnbueørret. Dette tyder på et stort potensial for forbedring, samtidig som det enda er uklart hva som er hovedårsaken til at problemet øker i så stor grad.
En litteraturstudie av mulige årsaker til økt forekomst av nefrokalsinose i havbruksnæringen synliggjorde flere kunnskapshull. I dette litteraturstudiet ble det presentert følgende hypotese: raske endringer i CO2 og O2 (fra høye nivå til lave nivå) som ofte forekommer under flytting til nye kar på land og/eller innad i samme kar, vil gi store kompensatoriske belastninger i nyren. Over tid vil dette kunne resultere i økt utfelling av salter i nyrene. Videre vil økt salttrykk via vannet og/eller fôret være en risikofaktor som videre påfører ekstra belastning på nyren og dermed forverrer tilstanden.
Nefrokalsinose er en tilstand der utfellinger av salter i nyrene, hovedsakelig kalsium, magnesium og fosfat, har blitt en av de mest vanlige og alvorlige produksjonslidelsene i norske settefiskanlegg. Flere hypoteser om underliggende årsaker har blitt fremsatt, blant annet bruk av salinitet i produksjonsvann, høye nivå av karbondioksid (CO2) og oksygen (O2), høye nivå av selenium og/eller lave nivåer av magnesium i fôret. Likefullt, i 2022 var nefrokalsinose rangert som den nest største årsaken til dødelighet, redusert velferd og vekst i norske settefiskanlegg, og var den lidelsen som økte mest i 2022, både for atlantisk laks og regnbueørret. Dette tyder på et stort potensial for forbedring, samtidig som det enda er uklart hva som er hovedårsaken til at problemet øker i så stor grad.
En litteraturstudie av mulige årsaker til økt forekomst av nefrokalsinose i havbruksnæringen synliggjorde flere kunnskapshull. I dette litteraturstudiet ble det presentert følgende hypotese: raske endringer i CO2 og O2 (fra høye nivå til lave nivå) som ofte forekommer under flytting til nye kar på land og/eller innad i samme kar, vil gi store kompensatoriske belastninger i nyren. Over tid vil dette kunne resultere i økt utfelling av salter i nyrene. Videre vil økt salttrykk via vannet og/eller fôret være en risikofaktor som videre påfører ekstra belastning på nyren og dermed forverrer tilstanden.
Dette prosjektet har som hovedmål å øke kunnskapen om nyrens funksjon, samt undersøke de fysiologiske endringene som forekommer når fisk er eksponert for ulike produksjonsmiljø som medfører økt risiko for nefrokalsinose i norske settefiskanlegg. Prosjektet skal videre utvikle spesifikke forebyggende tiltak og gi “beste praksis” til industrien med mål om å kunne redusere forekomsten av nefrokalsinose.
Prosjektet følger opp arbeid de siste årene hvor prosjektgruppen ved Universitetet i Bergen (UiB) har belyst tydelige kunnskapshull når det kommer til forståelsen av nyrefunksjon hos laksefisk. Videre bygger prosjektet på dialog med ulike næringsaktører, og det tidligere FHF-finansierte prosjektet “Betydning av tidspunkt og lengde av vintersignal i RAS for prestasjon i sjø ved utsett av stor postsmolt (BENCHMARK II)” (FHF-901682) og “Preventive” fra SFI CtrlAqua (Centre for Research Based Innovation in Closed Containment Aquaculture).
Hovedmål
Å frambringe ny kunnskap om nyrens funksjon og rolle i laksefisk, med spesielt fokus på fysiologiske endringer som forekommer når fisk utvikler nefrokalsinose. Dette vil kunne gi næringen en bedre forståelse av de ulike faktorene som trigger utfelling av salter i nyrene. Prosjekt har som hovedmål å utvikle forebyggende tiltak og “beste praksis” til næringen for å redusere nefrokalsinose, som vil forbedre fiskens helse og velferd.
Delmål
• Å fastslå hvilke faktorer i vannkvalitet (ionesammensetning, buffere, CO2, O2), fôr (mineraler og vitaminer) og håndteringsprotokoller (f.eks. overføringsprotokoller) som påvirker forekomsten av nefrokalsinose i ulike anlegg (med og uten nefrokalsinose).
• Å teste eksperimentelt hypotesen som omhandler de viktigste triggerfaktorer for utviklingen av nyrestein i laksefisk, samt mulige forskjeller i respons mellom atlantisk laks og regnbueørret.
• Å integrere makroskopisk scoringssystem på ulike anlegg med histologi, røntgen og ultralyd for å utvikle et universelt/felles scoringssystem i oppdrettsnæringen.
• Å fastslå hvilke fysiologiske og molekylærbiologiske endringer som forekommer i nyre, urin og blod (biomarkører og biokjemiskeanalyser) i frisk og nefrokalsinose påvirket atlantisk laks og regnbueørret.
• Å teste ulike forebyggende tiltak (fôr og produksjonsmiljø) som kan redusere og/eller stoppe utviklingen av nefrokalsinose.
• Å gi konkrete anbefalinger («beste praksis») til næringen for bruk av produksjonsprotokoller som forebygger og reduserer forekomsten av nefrokalsinose.
Nefrokalsinose er per dags dato en av de mest alvorlige og fremtredende produksjonslidelsene i norske settefiskanlegg. I dag finnes det ingen data på hvordan nefrokalsinose påvirker nyrens filtreringshastighet og urinkomposisjon i laksefisk. Videre finnes det ingen biomarkører som kan bidra til tidlig påvisning (<5 gram). Lindrende behandling eller ulike tiltaksstrategier som bidrar til reduksjon av sykdommen er fortsatt svært begrenset. Klassifiseringen av nefrokalsinose er heller ikke tydelig med hensyn til den svært varierende graden av klinisk evaluering som observeres i felt og ved histologiske funn. Fisk som får nefrokalsinose har sannsynligvis svært redusert nyrefunksjon, noe som vil være spesielt belastende under sjøvannsoverføringen, som er et av de mest kritiske tidspunktene i laksens livssyklus.
NephroReduce har som mål å genere kunnskap på flere områder, blant annet ved å se på produksjonsmiljø/fôrkomposisjon og forekomsten av nefrokalsinose i Norge, diagnostiske analyser, nyrefunksjon og forbyggende tiltak. Med denne tilnærmingen har man som målsetting å gi konkrete anbefalinger på de nevnte områdene for å redusere nefrokalsinose i norske settefiskanlegg. Dette vil kunne gi økt helse og velferd for fisken, som igjen vil gi bedre lønnsomhet for næringen både i settefiskfasen og i sjøfasen. I 2021 ble det satt ut 411 millioner atlantisk laks og 18 millioner regnbueørret til åpne merder i sjø. Av disse vil rundt 45 % utvikle nefrokalsinose (andel i prosent er fortsatt usikker) som innebærer at nesten 190 millioner smolt hvert år vil kunne være påvirket, som igjen kan gi økt dødelighet og sykdom både på land og i sjø. Til tross for at det er vanskelig å beregne nøyaktig økonomiske tap under produksjon vet man at mellom 36 og 40 millioner smolt dør før utsett til sjø og 58 millioner dør i sjøfasen før fisken når slakteriet. Nøyaktig hvor mye av dette som direkte eller indirekte skyldes nefrokalsinose er i dag fortsatt svært usikkert, men det er sannsynlig at det kan gi store regulatoriske problemer for fisken.
Kunnskap om nyrens funksjon hos fisk er begrenset. Bedre forståelse av nyrens funksjon i laksefisk vil derfor være av betydning for både forskning og næring. Prosjektet vil også frembringe direkte anbefalinger og “beste praksis” til næringen for å redusere forekomsten av nefrokalsinose under produksjon som er viktig for å bedre dagens situasjon i norske settefiskanlegg.
Dette prosjektet vil først undersøke vannkvalitet, typer og bruk av buffer, fôrformuleringer og de viktigste praksisene ved håndtering av fisk i kommersielle gjennomstrømningsanlegg (FTS) og resirkuleringsanlegg (RAS) for både atlantisk laks og regnbueørret i Norge (arbeidspakke 1 (AP1)). Deretter vil det sammenstilles tilgjengelig kunnskap fra tidligere arbeider og resultater fra AP1 til å eksperimentelt indusere nefrokalsinose for å bekrefte hypotesen som utløsende faktorer for nefrokalsinose (AP2). Samtidig vil man jobbe direkte i kommersielle anlegg for å videreutvikle eksisterende screening/diagnostikk-verktøy og nye molekylære biomarkører for tidlig påvisning av nefrokalsinose (AP3). Prosjektet har som mål å vurdere om det er riktig å klassifiseres nefrokalsinose som én enkelt diagnostisk kategori, eller om det bør være underkategorier for diagnosen. Prosjektet vil avklare den brede variasjonen i morfologi og plassering av utfellende stoffer, grad av og type nyrevevskader, samt kliniske tegn som observeres (AP3). Som en utvidelse av dette vil man også karakterisere nyrefunksjonen hos både frisk fisk og fisk som lider av nefrokalsinose, med formål om å utvikle preventive tiltak (AP4). Til slutt har prosjektet som mål å gi “beste praksis”-protokoller (håndbok online) for generell reduksjon av nefrokalsinose, og dermed frambringe bedre tiltaksstrategier, med mål om å forbedre fiskehelse og velferd til laks og ørret (AP5). Kontinuerlig formidling av funn og resultater i prosjektet vil bli gjennomført som beskrevet i AP5.
AP1: Vannkvalitet og forekomst av nefrokalsinose i Norge
Leder: Tom Ole Nilsen (UiB)
Økende risiko for nefrokalsinose skyldes sannsynligvis suboptimal vannkvalitet og økt salttrykk via fôr og/eller vann. Det oppstår komplekse interaksjoner mellom pH, temperatur og salinitet og formasjon av karbonatforbindelser, ofte referert til som karbonatsystemet. Endringer i alle disse vil påvirke fiskens interne salt/vann-balanse og syre-base-status. Både i RAS- og FTS-anlegg vil endringer i en eller flere av disse produksjonsbetingelsene gi varierende grad av kompensatoriske justeringer i nyrens funksjon. I AP1 vil man systematisk analysere vannkvalitet, ionesammensetning, bruk av buffer, biomasse og tetthet, fôrsammensetning samt prosedyrer for håndtering av fisk og karoverføringer som kan forårsake raske endringer i disse betingelsene, med spesielt søkelys på CO2- og O2-nivåer. Innsamling av data og grundig analyse av kommersielle anlegg for atlantisk laks og regnbueørret fra lav til høy forekomst av nefrokalsinose vil bli utført i anlegg fra et bredt geografisk område i Norge. Dette vil bidra til å identifisere felles risikofaktorer for både FTS- og RAS-anlegg i begge arter.
AP2: Verifisering av hypotese i eksperimentell setting
Leder: Kevin Stiller (Nofima)
I AP2 vil det gjennomføres et forsøk baserte på prosjektgruppens publiserte hypotese, flere samtaler med industripartnere og interne resultater fra tidligere prosjekt. Imidlertid vil man, baserte på kunnskapsinnhenting fra AP1, være åpen for å gjøre justeringer for det tentative forsøksoppsettet. Endelig forsøksoppsett vil bli bestemt av konsortiet og referansegruppe de første 3–4 måneder av prosjektet. Atlantisk laks og regnbueørret vil bli fordelt i singel RAS-tanker hvor fisk (20–30 gram), sorteres og settes på ulike CO2- og O2-regimer og salinitetsbelastning. Ved å bruke separate RAS-system har man muligheten til å etterligne produksjonsmiljø i kommersielle anlegg med svært høy nøyaktighet, og i tråd med kunnskapen fra AP1.
Gruppe 1: (kontroll gruppe): Konstant CO2 på 5 mg/l og normalt O2 på 85–90 %
Gruppe 2: Økende CO2 fra 5 mg/l til 25 mg/l og normalt O2 på 85–90 %
Gruppe 3: Økende CO2 fra 5 mg/l til 25 mg/l og høyt O2 på 110 %
Gruppe 2 og 3 vil etter en periode med høye nivåer utsettes for en rask reduksjon i CO2 (og O2; gruppe 3) tilbake til utgangsnivåene for å simulere en overføring til nye tanker i kommersielle anlegg. Etter en ny belastningsperiode med høyt CO2 og O2, utsettes fisken for en ny rask reduksjon i CO2 for å simulere enda en karoverføring i kommersielle anlegg. Alle tre eksponeringsgrupper vil ha to undergrupper, én som får ferskvann og én som får økende saltnivåer i henhold til de mest vanlige produksjonsprotokollene i Norge. Flere utvalgte verktøy og analyser vil bli tatt i bruk som beskrevet i AP3 og AP4.
AP3: Diagnostikk verktøy og molekylære biomarkører for bedre screening og tidlig påvisning
Leder: Kirsti Hjelde (Nofima)
Formålet med arbeidspakken vil være å videreutvikle bruken av ikke-dødelige røntgen og ultralyd, samt histologi (dødelig) for å identifisere og klassifisere grad av nefrokalsinose i både eksperimentelt og kommersiell fase av prosjektet ved hjelp av kunstig intelligens (KI)-programvarer. I tillegg vil den andre delen av arbeidspakken se nærmere på bruken av molekylære biomarkører i nyren, men også i blod og urin for å kunne skille mellom frisk og nefrokalsinosepåvirket fisk.
AP3.1. Leder: Kirsti Hjelde (Nofima): I denne arbeidspakken vil man beskrive morfologien og plasseringen av utfellende stoffer, grad og type av nyreskader og kliniske tegn som observeres ved hjelp av grundig histologisk analyse (Patogen AS) og KI-programvare for kvantitativ bildeanalyse (Skretting ARC) av nyreskader og mineralutfelling. Den ikke-dødelige diagnostikken skal videreutvikles og muliggjøre rask evaluering av store fiskegrupper i kommersielle anlegg via røntgen (Nofima) og ultralyd (Aquaticode) for å sikre nøyaktige og pålitelige data. Via dette arbeidet skal det utvikles en algoritme for klassifisering av nefrokalsinose (KI) i denne arbeidspakken. Dette muliggjør også effektiv sortering og isolering av påvirket fisk fra en større produksjonsgruppe og muliggjør målrettet behandling (AP4). I tillegg vil histologisk diagnostikk bli optimalisert opp mot KI med formål om å gjøre evaluering av innsendte histologiprøver raskere og enklere både for oppdretter og fiskehelsetjenesten.
AP3.2. Leder: Marius Takvam (UiB): De siste årene har UiB utviklet flere biomarkører som har vist seg lovende for å evaluere nyrefunksjon i laksefisk. Gode normalprofiler for disse molekylærbiologiske markørene er viktig for å forstå nyrens normale funksjon opp mot en nyre påvirket av nefrokalsinose. Slike normalprofiler er også viktig for å undersøke og forstå hvordan nyrens transportmekanismer blir påvirket av endringene i produksjonsmiljøet. Fordelen med disse biomarkørene er at de kan brukes svært tidlig i produksjonen (<5 gram), hvor andre typer diagnostikkverktøy er utfordrende å bruke. Forstyrrelser i disse biomarkørene kan muligens detekteres før utfelling av saltene forekommer. I tillegg til disse biomarkørene vil man bruke en innovativ tilnærming for å vurdere helsestatusen til atlantisk laks og regnbueørret ved hjelp av MALDI-TOF-MS-analyser for å profilere proteomet i blod og urin. Dette skal man kombinere med eksisterende parametere som tidligere er knyttet til nefrokalsinose. Dermed kan man nøye undersøke forskjellen mellom friske og syke individer som vil tillate rask, sensitive og kostnadseffektive ikke-dødelige prøver fra blod og urin.
AP4: Nyrefunksjon i frisk og syk laksefisk og behandling av tilstanden
Leder: Marius Takvam (UiB)
I denne arbeidspakken vil man nærmere undersøke nyrefunksjon hos både frisk og nefrokalsinosepåvirket laksefisk (atlantisk laks og regnbueørret) i utvalgte anlegg hos industripartnere. Utvalgte fôrbehandlinger vil bli levert av Skretting ARC med sikte på å utvikle en målrettet behandling for å redusere nefrokalsinose.
AP4.1. Leder: Marius Takvam (UiB): Katerisering av urinblæren vil tillate målinger av urinvolum og sammensetning, samt beregninger av filtreringshastighet, for å fastslå normal eller kronisk nedsatt nyrefunksjon. Nyren har viktige roller for å regulere salt- og vannbalanse og syre-base-status i fisk. Det eksisterer imidlertid svært begrensede data og kunnskap om nyrefunksjon, spesielt hos laksefisk, når det gjelder måling av filtrasjonsrate. Omfattende kompetanse ved University of British Columbia (UBC) og UIB i bruk av kateriseringsteknikker vil tillate detaljerte målinger av disse parameterne i parr, smolt og post-smolt. Dette vil gi svært viktig referanseverdier for å forstå de fysiologiske forstyrrelsene som undersøkes i AP4.2.
AP4.2. Leder: Tom Ole Nilsen (UiB): Fisk vil bli sortert ved hjelp av ikke-dødelig røntgenmetode i ulike alvorlighetskategorier: Kategori 1 (score 0–1), Kategori 2 (score 1–2) og kategori 3 (score 2–3). De ulike kategoriene vil bli plassert i ulike kar som får produksjonsvann fra de kommersielle karene på anlegget. Fisk fra de ulike kategoriene vil deretter bli kategorisert for å vurdere nyrefunksjon via en 24-timers urinmåling. Urin og blod vil bli hentet fra samme fisk for videre analyser samtidig som nyrevev for histologi og qPCR-analyse vil bli tatt ut etter fullført katerisering (se AP3). Etter at urin er blitt analysert fra både laks og ørret vil man lage kunstig urin og/eller bruke ekte urin for å fastslå hvilke pH-område og miljøforhold (f.eks. konsentrasjoner av kalsium, magnesium og fosfor) som resulterer i aggregering og utfelling av steiner. Dette vil muliggjøre observasjoner av nyresteinformasjon i sanntid.
AP4.3. Leder: Marius Takvam (UiB): Fisk vil sorteres ved hjelp av røntgen (Nofima) og/eller ultralyd (Aquaticode) og deles i to ulike grupper: en gruppe med mild nefrokalsinose (score 1–2) og en med alvorlig nefrokalsinose (score 3–4). Her vil man teste ulike fôringredienser og/eller endringer i vannmiljø med potensiale for å redusere nyrestein for å undersøke om behandling er mulig for fisk rammet av ulike alvorlighetsgrader av nefrokalsinose. Man vil undersøke progresjon eller tilbakegang av nefrokalsinose ved gjentatte røntgenundersøkelser og/eller ultralyd av samme individ før og etter behandling. Vekst og helse vil bli nøye overvåket i begge gruppene, når behandlingen administreres. En slik tilnærming vil gi unike og individspesifikke data for å vurdere effekten og potensiale for målrettet behandling i kommersiell skala.
AP5: Prosjektledelse, kommunikasjon og formidling av prosjektresultat
Leder: Tom Ole Nilsen (UiB)
Det vil bli utarbeidet en rapport som skal fungere som en praktisk og åpen digital håndbok om hvordan man kan forebygge, redusere og behandle nefrokalsinose i moderne akvakultur på land. Denne digitale håndboken skal skrives i samråd med hele konsortiet.
Effektiv og kontinuerlig kommunikasjon av prosjektfunn (milepæler) vil bli gjennomført ved å arrangere samlinger for interesserte parter for å informere om viktig funn gjennom prosjektet.
For å sikre god informasjonsflyt med alle prosjektpartnere vil man etablere et påvirkningsforum innenfor prosjektgruppen der presentasjoner av resultat, etterfulgt av påfølgende tilbakemeldinger og diskusjon fra deltagende industripartnere og referansegruppen finner sted.
NCE Seafood Cluster vil ha ansvar for en egen nettside for prosjektet og for å arrangere åpne og offentlige samlinger i løpet av prosjektperioden. Resultater fra prosjektet vil også publiserte i internasjonale tidsskrifter, men også formidles via nasjonale tidsskrifter som Forskning.no og nettaviser/nyhetsmedia som ILaks, Kyst.no, Norsk Fiskeoppdrett og lignende kommunikasjonskanaler.
I tillegg til den åpne digitale håndboken (beskrevet i AP5) vil prosjektgruppen formidle resultatene på nasjonale og internasjonale konferanser av interesse for vitenskapelig miljø og representanter fra havbruksnæringen.
For å sikre god informasjonsflyt med alle prosjektpartnere vil man etablere et påvirkningsforum innenfor prosjektgruppen der presentasjoner av resultat, etterfulgt av påfølgende tilbakemeldinger og diskusjon fra deltagende industripartnere og referansegruppen finner sted.
NCE Seafood Cluster vil ha ansvar for en egen nettside for prosjektet og for å arrangere åpne og offentlige samlinger i løpet av prosjektperioden. Resultater fra prosjektet vil også publiserte i internasjonale tidsskrifter, men også formidles via nasjonale tidsskrifter som Forskning.no og nettaviser/nyhetsmedia som ILaks, Kyst.no, Norsk Fiskeoppdrett og lignende kommunikasjonskanaler.
I tillegg til den åpne digitale håndboken (beskrevet i AP5) vil prosjektgruppen formidle resultatene på nasjonale og internasjonale konferanser av interesse for vitenskapelig miljø og representanter fra havbruksnæringen.